Metoda disk difuzije
Ne više od 6 diskova impregniranih antibioticima postavlja se na površinu guste hranjive podloge zasijane preko neprekidnog travnjaka sa proučavanim usjevom, na udaljenosti od najmanje 2 cm jedan od drugog. Rezultati se bilježe nakon 18-24 sata inkubacije u termostatu prema promjeru zone bez rasta oko diskova sa antibioticima. Prisustvo rasta oko diska ukazuje na neosjetljivost ovog mikroba na antibiotik. Za interpretaciju rezultata koriste se posebne tabele.
Slika 1. Određivanje osjetljivosti
mikroorganizmi metodom disk difuzije:
1 – mikroorganizam osjetljivo na antibiotik;
2 – mikroorganizam umjereno otporan na antibiotik;
3 – mikroorganizam stabilan na antibiotik.
Metoda E-testiranja
Princip metode. Određivanje osjetljivosti mikroorganizma provodi se slično kao i ispitivanje metodom disk difuzije. Razlika je u tome što se umjesto diska s antibiotikom koristi E-test traka koja sadrži gradijent koncentracija antibiotika od maksimalne do minimalne. Na preseku elipsoidne zone inhibicije rasta sa E-test trakom, dobija se vrednost minimalne inhibitorne koncentracije (MIC).
Slika 2. Određivanje osjetljivosti mikroorganizama pomoću E-testova
Metoda serijskog razrjeđivanja u mediju bujona
U epruvetama koje sadrže 1 ml Mueller-Hinton bujona pripremite serijska dvostruka razrjeđenja antibakterijskog lijeka, na primjer 100 µg/ml - 1., 50 µg/ml - 2., 25 µg/ml - 3., 12.5 µg/ml – 4. itd. Zatim se u svaku epruvetu dodaje 0,1 ml testirane bakterijske suspenzije. Istovremeno se daje kontrola rasta (1 ml Mueller-Hinton bujona i 0,1 ml bakterijske suspenzije). Usjevi se inkubiraju na 37°C 18-24 sata, nakon čega se bilježe rezultati. Odsustvo zamućenja u mediju ukazuje na usporavanje rasta bakterija u prisustvu date koncentracije lijeka.
Slika 3. Određivanje MIC vrijednosti razrjeđivanjem u tečnom hranljivom mediju
Minimalna inhibitorna koncentracija (MIC) je najniža koncentracija antibiotika (u μg/ml ili mg/l) koja potpuno inhibira vidljivi rast bakterija in vitro.
2 Određivanje osjetljivosti različitih sojeva stafilokoka na antibiotike standardnom disk metodom
|
Antibiotik |
Zona inhibicije rasta, mm |
Karakteristike deformacije |
Kultura koja se proučava je osjetljiva na ___________________________________________________
umjereno otporan na _______________________________________________________________________________,
otporan na ___________________________________________________________________________________.
3 Određivanje minimalne inhibitorne koncentracije (MIC) penicilina metodom serijskih razblaženja.
zaključak: MIC penicilina za ispitivani soj je _____________________________________
Prednosti metode:________________________________________________________________________________
Nedostaci metode:________________________________________________________________________________
4 Identifikacija i registracija antagonističkih efekata različitih vrsta bakterija.
Mikrob antagonist i test sojevi okomiti na njega inokuliraju se prugom duž prečnika na ploču sa MPA. Rezultati se bilježe dan nakon sjetve. Prisustvo i stepen antagonističkog delovanja određuju se veličinom zona inhibicije rasta test kultura.
Linija sjetva________________________________
zaključak: najveći antagonistički efekat je otkriven za test sojeve (navesti vrste) ________________________________________________________________________________________________
LEKCIJA br. 8
PREDMET: ZAVRŠNI ČAS NA TEMU: “ISTORIJSKE FAZE U RAZVOJU MIKROBIOLOGIJE, MORFOLOGIJE, FIZIOLOGIJE I GENETKE MIKROORGANIZAMA.”
Oblici i veličine pravih bakterija. Karakteristike sferičnih, štapićastih i uvijenih oblika pravih bakterija.
Struktura bakterija. Glavne razlike između prokariotske ćelije i eukariotske ćelije.
Ćelijski zid gram-pozitivnih i gram-negativnih bakterija.
Vrste mikroskopskih preparata. Tehnika pripreme fiksnih preparata.
Tehnika mikroskopije u svjetlosnom mikroskopu. Proučavanje morfologije mikroorganizama u elektronskom mikroskopu.
Tintorijalna svojstva mikroba. Boje. Jednostavne metode bojenja fiksnih preparata.
Principi klasifikacije patogenih prokariota (Burgee, 2001).
Zaštitni uređaji u mikroorganizmima. Spore, stadijumi i uslovi nastanka spora, biološki značaj.
Bakterijske kapsule, njihovo značenje.
Flagele, njihova struktura. Cilia. Seksualno opijanje.
Kompleksne metode slikanja. Tehnike bojenja po Gramu, Ziehl-Neelsenu, Burri-Ginsu, Neisseru.
Metode proučavanja mikroorganizama u živom stanju. CON test. Princip metode.
Spirohete. Sistematski položaj i morfologija spiroheta. Karakteristike ultrastrukture i hemijskog sastava. Metode istraživanja.
Aktinomiceti, morfologija, ultrastruktura, hemijski sastav. Patogene vrste. Uloga aktinomiceta u prirodi i medicini. Metode detekcije.
Taksonomija klamidije. Morfologija, struktura, metode detekcije. Ciklus razvoja klamidije.
Rikecije, morfologija, ultrastruktura, hemijski sastav. Patogene vrste.
mikoplazme. Klasifikacija. Filogeneza. Metode detekcije.
Defektni oblici mikroba: protoplasti, sferoplasti, L-oblici.
Ishrana bakterija. Nutrijenti su izvori ugljika i dušika. Klasifikacija bakterija prema vrsti ishrane Autotrofi i hemoorganotrofi
Faktori rasta i njihovi izvori. Izvori mineralnih elemenata.
Metode i mehanizmi prijenosa hranjivih tvari kroz membranu.
Energetske potrebe bakterija. Načini dobivanja energije iz autotrofa (fotosinteza, kemosinteza). Izvori i načini dobivanja energije u hemoorganotrofima.
Aerobni i anaerobni tipovi biološke oksidacije u bakterijama. Aerobne, anaerobne, fakultativno anaerobne i mikroaerofilne bakterije. Metode za stvaranje anaerobnih uslova.
Ciljevi, faze, prednosti i nedostaci bakteriološkog (kulturološkog) metoda istraživanja.
Rast i razmnožavanje mikroorganizama. Metode reprodukcije. Binarna (jednostavna) fisija, mehanizam. Reprodukcija bakterijskih populacija.
Principi i metode uzgoja bakterija. Nutritivne potrebe mikroba.
Hranljivi medij za uzgoj bakterija. Zahtjevi za hranljive podloge. Klasifikacija hranljivih podloga.
Uslovi i tehnike uzgoja bakterija. Tehnika sjetve na hranljive podloge. Obrasci i priroda rasta bakterija na čvrstim i tekućim hranjivim podlogama.
Metode za izolaciju čistih kultura aerobnih i anaerobnih bakterija.
Svojstva mikroorganizama koji se koriste za identifikaciju izolovanih kultura.
Bakterijski enzimi, klasifikacija. Metode za proučavanje biohemijskih svojstava mikroorganizama. Praktična upotreba biohemijske aktivnosti u identifikaciji bakterija
Određivanje saharolitičkih svojstava, sastav Hiss medija; određivanje proteolitičkih svojstava, određivanje aktivnosti katalaze i oksidaze.
Princip rada i karakteristike upotrebe uređaja za automatsku identifikaciju bakterijskih kultura (hemokultivator, automatski analizator).
Značajke uzgoja rikecija i klamidije.
Bakteriofagi (fagi). Istorija otkrića. Morfologija, strukturne karakteristike, hemijski sastav i svojstva faga.
Virulentni fagi. Faze interakcije sa bakterijskom ćelijom. Rezultati interakcije između faga i ćelije. Umjereni fagi. Profag. Fenomen lizogenije. Konverzija faga.
Metode izolacije i titriranja bakteriofaga na čvrstim i tekućim hranjivim podlogama. Primjena faga u mikrobiologiji i medicini. Dijagnostika faga i tipizacija faga.
Nasljednost. Organizacija genetskog aparata u bakterijama (nukleoidi, plazmidi, Is
-sekvencije, transpozoni).
Principi funkcionisanja bakterijskog genoma. Organizacija operona. Genotip i fenotip.
Plazmidi, klasifikacija, struktura i svojstva plazmida. R-plazmid, karakteristike strukture i funkcije. Bakteriocinogeni plazmidi.
Mikrobna varijabilnost. Promjene u bakterijama, značaj, glavne manifestacije i svojstva (nenasljedna priroda, prilagodljivost, visoka učestalost direktnih i reverznih promjena, mnogi inducirajući faktori).
Genotipska varijabilnost. Mutacije i njihova klasifikacija. Mutageni. Fenotipske manifestacije mutacija. Sudbina mutanata. Disocijacija u bakterijama. Uticaj selekcije. Sistem za popravku oštećenja genoma.
Varijabilnost rekombinacije. Mehanizmi formiranja kombinovanih genoma. Učestalost promjena individualnih karakteristika. Transformacija, transdukcija, konjugacija.
Praktični značaj znanja o genetici mikroba. Principi genetskog mapiranja.
Metode genetske analize (molekularna hibridizacija, polimerazna lančana reakcija, blotiranje, sekvenciranje).
Pojam genetskog inženjeringa i upotreba njegovih metoda u mikrobiologiji i biotehnologiji. Proizvodnja i upotreba genetski modifikovanih vakcina i citokina.
Antimikrobne mjere. Utjecaj faktora okoline na mikrobe. Djelovanje fizičkih faktora (temperatura, sušenje, zračenje, ultrazvuk, osmotski pritisak). Djelovanje hemijskih faktora.
Ciljevi, metode, sredstva i predmeti sterilizacije i dezinfekcije u medicinskoj i mikrobiološkoj praksi. Kontrola kvaliteta dezinfekcije. Kontrola sterilizacije i sterilnosti. Metode izvođenja.
Hemoterapijski lijekovi. Svojstva. Glavne grupe hemoterapijskih lijekova. Mehanizmi djelovanja na bakterije. Koncept selektivnosti i „cilja“ djelovanja.
Antibiotici. Definicija. Proizvođači antibiotika. Sintetički i polusintetički antibiotici.
Glavne grupe antibiotika po hemijskoj strukturi. Beta-laktamski antibiotici Tetraciklini. Aminoglikozidi. Makrolidi i azolidi. Ansamicini (rifampicini). Levomicetin. Fluorokinolonski antibiotici. Linkomicin. Polimiksini. Glikopeptidi
Klasifikacija antibiotika na osnovu mehanizma djelovanja na bakterijsku ćeliju.
Mehanizmi rezistencije mikroorganizama na antibakterijske lijekove.
Metode za određivanje osjetljivosti bakterija na antibiotike i druge lijekove za kemoterapiju. Tehnika za postavljanje, snimanje i procenu osetljivosti metodom diska, E-test, serijska razblaženja.
LEKCIJA br.9
PREDMET: EKOLOGIJA BAKTERIJA. INFEKCIJA. PATOGENI MIKROORGANIZMI. MIKROBIALNI TOKSINI. BIOLOŠKA (EKSPERIMENTALNA) METODA.
CHECKLIST
Mikroflora ljudskog organizma . Normalna (rezidentna) ljudska mikroflora. Autohtona i alohtona, parijetalna i luminalna mikroflora. Formiranje i razvoj normalne mikroflore. Funkcije normalne mikroflore: antiinfektivna, metabolička, imunobiološka, antitoksična.
Dismikrobiocenoza (disbakterioza), uzroci, vrste, principi korekcije.
Koncept infekcije. Definicija, opšte karakteristike. Razlike između zaraznih i nezaraznih bolesti.
Uloga mikroorganizma u infektivnom procesu. Infektivna doza. Metode infekcije. Ulazna kapija. Patogenost i virulentnost. Genetska kontrola patogenosti i virulencije. Faktori koji povećavaju i smanjuju virulentnost mikroba.
Faktori patogenosti. Metode za određivanje virulencije, jedinice. Obvezni patogeni i uslovno patogeni mikroorganizmi.
Toksičnost i toksičnost mikroorganizama. Endotoksini, svojstva, proizvodnja, primjena. Egzotoksini, svojstva, proizvodnja, mjerne jedinice. Vrste egzotoksina, mehanizam djelovanja.
Uloga makroorganizma u nastanku i toku zaraznih bolesti. Nasljedni faktori. Anatomsko i fiziološko stanje organizma. Uloga životnih uslova u nastanku i toku zaraznih bolesti. Prirodni faktori. Društveni faktori.
Klasifikacija infektivnih procesa prema težini, prirodi patogena, izvoru infekcije, načinu prenošenja patogena i mehanizmu infekcije, te prevalenci. Klasifikacija infektivnih procesa prema lokalizaciji mikrobnog žarišta, trajanju tijeka i učestalosti infekcije.
Dinamika infektivnog procesa, njegove karakteristike.
Biološki (eksperimentalni) metod istraživanja, faze, evaluacija. Laboratorijske životinje. Metode infekcije.
LABORATORIJSKI RAD
1 Studija normalne mikroflore.
A) Sjetva radi proučavanja normalne mikroflore kože ruku na Endo mediju i krvni agar replika metoda.
Princip metode: navlažite sterilne komade filter papira 1x1 cm u Petrijevoj posudi sa sterilnom fiziološkom otopinom. rješenje. Koristeći sterilnu pincetu, stavite komad papira na površinu kože koju treba pregledati na 0,5 minuta. Stavite papir na površinu gustog hranljivog medija (štampa) na 1 minut. Uklonite papir. Inkubirajte ploče sa otiscima na 37 0 C tokom 24-48 sati.
C) Sprovesti evidenciju inokulacije mikroflore, pripremiti preparate od različitih vrsta kolonija, bojenje po Gramu, mikroskop (u demonstracionim inokulacijama).
Obračun inokulacije mikroflore:
Mikroskopski pregled preparata:
|
droga______________ _______________________ Bojanje _______________ _______________________ |
droga______________ _______________________ Bojanje _______________ _______________________ |
2 Procjena adhezivnostiE. colisvojom sposobnošću da se adsorbiraju na površini crvenih krvnih stanica
Princip metode: U suspenziju eritrocita se dodaje kultura test mikroorganizama. Nakon inkubacije pripremaju se brisevi, boje se i pod mikroskopom se određuje prosječan broj bakterija adsorbiranih na jednom crvenom krvnom zrncu.
U ovom slučaju, crvena krvna zrnca se koriste kao model ćelije osjetljivog mikroorganizma.
3 Određivanje invazivnih enzima u stafilokoku
1. Plasmocoagulase
Princip metode: Test kultura se dodaje u epruvetu koja sadrži citratnu krvnu plazmu kunića. Nakon inkubacije u termostatu, rezultat se uzima u obzir. Ako je rezultat pozitivan, plazma se zgrušava (koagulira).
2.Fibrinolizin
Princip metode: Test kultura se dodaje u epruvetu sa fibrinom (krvni ugrušak ispran sa crvenih krvnih zrnaca). Nakon inkubacije u termostatu, rezultat se uzima u obzir. Ako je rezultat pozitivan, ugrušak se rastvara.
3.Hijaluronidaza
Princip metode: Test kultura se dodaje u epruvetu sa hijaluronskom kiselinom (HA). Nakon inkubacije u termostatu dodaje se reagens koji izaziva koagulaciju HAA i rezultat se uzima u obzir. Ako je rezultat pozitivan (zbog razgradnje HAA), ugrušak se ne stvara.
4.lecitovitelaza (lecitinaza)
Princip metode: izolovane kulture stafilokoka se inokuliraju na agar od žumanca i soli koji sadrži 7,5% natrijum hlorida i suspenziju žumanca. Ako je rezultat pozitivan, oko kolonija virulentnih stafilokoka formira se dugin oreol zbog razgradnje lecitina sadržanog u žumanjku kokošjeg jajeta.
Zaključak: (navedite enzime virulencije svakog od dva proučavana soja) ________________________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________________
Bakterijski toksini
Toksičnost ___________________________________________________________________________________
Toksigenost ________________________________________________________________________________
Endotoksin ___________________________________________________________________________________
Endotoksični šok _______________________________________________________________________________
Praktična primjena endotoksina:
Egzotoksin ___________________________________________________________________________________
Anatoxin ___________________________________________________________________________________
Shema za dobivanje egzotoksina i toksoida.
1.____________________________________________________________________________________________
2.____________________________________________________________________________________________
4.____________________________________________________________________________________________
Praktična upotreba toksoida:
1.____________________________________________________________________________________________
2.____________________________________________________________________________________________
3.____________________________________________________________________________________________
Predavanje govori o glavnim metodama za određivanje osjetljivosti in vitro mikroorganizama na antimikrobne lijekove (difuzija diska, E-testovi, metode razrjeđivanja). Odraženi su pristupi empirijskom i etiotropnom propisivanju antibiotika u kliničkoj praksi. Razmatraju se pitanja interpretacije rezultata određivanja osjetljivosti sa kliničkog i mikrobiološkog stanovišta.
Trenutno u kliničkoj praksi postoje dva principa za propisivanje antibakterijskih lijekova: empirijski i etiotropni. Empirijski recept za antibiotike na osnovu poznavanja prirodne osjetljivosti bakterija, epidemioloških podataka o otpornosti mikroorganizama u regiji ili bolnici, kao i rezultata kontroliranih kliničkih studija. Nesumnjiva prednost empirijskog propisivanja kemoterapije je mogućnost brzog početka terapije. Osim toga, ovaj pristup eliminira troškove dodatnog istraživanja.
Međutim, ako je antibakterijska terapija neefikasna, u slučaju bolničkih infekcija, kada je teško pogoditi uzročnika i njegovu osjetljivost na antibiotike, teže provoditi etiotropnu terapiju. Etiotropno propisivanje antibiotika uključuje ne samo izolaciju infektivnog agensa iz kliničkog materijala, već i određivanje njegove osjetljivosti na antibiotike. Dobivanje tačnih podataka moguće je samo uz kompetentnu provedbu svih faza bakteriološkog istraživanja: od uzimanja kliničkog materijala, transporta u bakteriološku laboratoriju, identifikacije patogena do određivanja njegove osjetljivosti na antibiotike i interpretacije dobivenih rezultata.
Drugi razlog potrebe za utvrđivanjem osjetljivosti mikroorganizama na antibakterijske lijekove je dobivanje epidemioloških podataka o strukturi rezistencije patogena vanbolničkih i bolničkih infekcija. U praksi se ovi podaci koriste za empirijsko propisivanje antibiotika, kao i za formiranje bolničkih formulara.
Metode za određivanje osjetljivosti na antibiotike
Metode za određivanje osjetljivosti bakterija na antibiotike podijeljene su u 2 grupe: difuzijske i dilucione metode.
Prilikom određivanja osjetljivosti metodom disk difuzije, bakterijska suspenzija određene gustine (obično ekvivalentne McFarland standardu zamućenosti od 0,5) se nanosi na površinu agara u Petrijevoj posudi, a zatim se stavljaju diskovi koji sadrže određenu količinu antibiotika. . Difuzija antibiotika u agar dovodi do stvaranja zone supresije rasta mikroorganizama oko diskova. Nakon inkubacije posuda u termostatu na temperaturi od 35 o -37 o C preko noći, rezultat se uzima u obzir mjerenjem prečnika zone oko diska u milimetrima ().
Slika 1. Određivanje osjetljivosti mikroorganizama metodom disk difuzije.
Određivanje osjetljivosti mikroorganizma pomoću E-testa provodi se slično kao i ispitivanje metodom disk difuzije. Razlika je u tome što se umjesto diska s antibiotikom koristi E-test traka koja sadrži gradijent koncentracija antibiotika od maksimalne do minimalne (). Na preseku elipsoidne zone inhibicije rasta sa E-test trakom, dobija se vrednost minimalne inhibitorne koncentracije (MIC).
Slika 2. Određivanje osjetljivosti mikroorganizama pomoću E-testova.
Nesumnjiva prednost difuzijskih metoda je jednostavnost ispitivanja i dostupnost u bilo kojoj bakteriološkoj laboratoriji. Međutim, s obzirom na visoku cijenu E-testova, metoda disk difuzije se obično koristi za rutinski rad.
Metode uzgoja zasnivaju se na upotrebi dvostrukih serijskih razrjeđenja koncentracija antibiotika od maksimalne do minimalne (na primjer, od 128 μg/ml, 64 μg/ml itd. do 0,5 μg/ml, 0,25 μg/ml i 0,125 μg/ml). U tom se slučaju antibiotik u različitim koncentracijama dodaje u tekući hranljivi medij (juhu) ili agar. Bakterijska suspenzija određene gustine, koja odgovara McFarland standardu zamućenosti od 0,5, zatim se stavlja u antibiotsku juhu ili na površinu agar ploče. Nakon inkubacije preko noći na temperaturi od 35 o -37 o C, dobijeni rezultati se bilježe. Prisustvo rasta mikroorganizama u bujonu (zamućenje bujona) ili na površini agara ukazuje da je data koncentracija antibiotika nedovoljna za suzbijanje njegove vitalnosti. Kako se koncentracija antibiotika povećava, rast mikroorganizma se pogoršava. Prvom najnižom koncentracijom antibiotika (iz serije serijskih razrjeđenja), pri čemu rast bakterija nije vizualno određen, smatra se minimalna inhibitorna koncentracija (MIC). MIC se mjeri u mg/l ili μg/ml ().
Slika 3. Određivanje MIC vrijednosti razrjeđivanjem u tečnom hranljivom mediju.
Interpretacija rezultata osjetljivosti
Na osnovu dobijenih kvantitativnih podataka (prečnik zone inhibicije rasta antibiotika ili MIC vrednost), mikroorganizmi se dele na osetljive, srednje rezistentne i rezistentne (). Za razliku između ove tri kategorije osjetljivosti (ili otpornosti) tzv granične koncentracije(prelomna tačka) antibiotik (ili granične vrednosti prečnika zone inhibicije rasta mikroorganizama).
Slika 4. Interpretacija rezultata određivanja osjetljivosti bakterija u skladu sa MIC vrijednostima.
Granične koncentracije nisu nepromjenjive vrijednosti. Mogu se revidirati ovisno o promjenama u osjetljivosti mikrobne populacije. Izradu i reviziju kriterijuma tumačenja vrše vodeći stručnjaci (kemoterapeuti i mikrobiolozi) koji su članovi posebnih komisija. Jedan od njih je američki nacionalni komitet za kliničke laboratorijske standarde (NCCLS). Trenutno su NCCLS standardi priznati u cijelom svijetu i koriste se kao međunarodni standardi za procjenu rezultata određivanja osjetljivosti bakterija u multicentričnim mikrobiološkim i kliničkim studijama.
Postoje dva pristupa tumačenju rezultata osjetljivosti: mikrobiološki i klinički. Mikrobiološka interpretacija temelji se na analizi raspodjele koncentracija antibiotika koje potiskuju vitalnost bakterija. Klinička interpretacija se zasniva na proceni efikasnosti antibiotske terapije.
Osetljivi mikroorganizmi (osetljivi)
Klinički, bakterije se klasificiraju kao osjetljive (uzimajući u obzir dobivene parametre in vitro), ako se kod liječenja infekcija uzrokovanih ovim mikroorganizmima standardnim dozama antibiotika uočava dobar terapeutski učinak.
U nedostatku pouzdanih kliničkih informacija, podjela na kategorije osjetljivosti zasniva se na zajedničkom obračunu dobijenih podataka in vitro, i farmakokinetika, tj. na koncentracije antibiotika koje se mogu postići na mjestu infekcije (ili u krvnom serumu).
Otporni mikroorganizmi
Bakterije se klasifikuju kao rezistentne (rezistentne) kada pri liječenju infekcije uzrokovane ovim mikroorganizmima nema efekta terapije čak ni pri primjeni maksimalnih doza antibiotika. Takvi mikroorganizmi imaju mehanizme otpornosti.
Mikroorganizmi sa srednjom otpornošću (srednja)
Klinički, srednja rezistencija kod bakterija se podrazumijeva kada infekcije uzrokovane takvim sojevima mogu imati različite terapijske ishode. Međutim, liječenje može biti uspješno ako se antibiotik koristi u dozama većim od standardnih ili je infekcija lokalizirana na području gdje se antibakterijski lijek akumulira u visokim koncentracijama.
Sa mikrobiološke tačke gledišta, bakterije sa srednjom rezistencijom uključuju subpopulaciju koja se, u skladu sa MIC vrednostima ili prečnikom zone, nalazi između osetljivih i rezistentnih mikroorganizama. Ponekad se srednjerezistentni sojevi i rezistentne bakterije kombiniraju u jednu kategoriju otpornih mikroorganizama.
Treba napomenuti da je klinička interpretacija osjetljivosti bakterija na antibiotike uvjetna, budući da ishod terapije ne ovisi uvijek samo o aktivnosti antibakterijskog lijeka prema patogenu. Prema istraživanjima, kliničari su upoznati sa slučajevima kada su mikroorganizmi otporni in vitro, dobio je dobar klinički efekat. Suprotno tome, ako je patogen osjetljiv, terapija može biti neučinkovita.
U određenim kliničkim situacijama, kada su rezultati ispitivanja osjetljivosti konvencionalnim metodama nedovoljni, određuje se minimalna baktericidna koncentracija.
Minimalna baktericidna koncentracija (MBC)- najniža koncentracija antibiotika (mg/l ili μg/ml), koja se tokom ispitivanja in vitro uzrokuje smrt 99,9% mikroorganizama sa početnog nivoa u određenom vremenskom periodu.
Vrijednost MBC se koristi u terapiji antibioticima koji imaju bakteriostatski učinak, ili u odsustvu efekta od antibakterijske terapije kod posebne kategorije pacijenata. Posebni slučajevi za određivanje MBC mogu biti, na primjer, bakterijski endokarditis, osteomijelitis ili generalizirane infekcije kod pacijenata sa stanjima imunodeficijencije.
Zaključno, želio bih napomenuti da danas ne postoje metode koje bi nam omogućile da sa apsolutnom sigurnošću predvidimo klinički učinak antibiotika u liječenju zaraznih bolesti. Međutim, ovi rezultati osjetljivosti mogu poslužiti kao dobar vodič za kliničare da odaberu i prilagode antibakterijsku terapiju.
Tabela 1. Kriteriji za tumačenje osjetljivosti bakterija
Etest® je inertna plastična traka koja sadrži antimikrobni agens u koncentracijskom gradijentu od minimuma do maksimuma, u rasponu koji je ekvivalentan 15 2-strukih razrjeđenja. Na drugoj strani trake nalazi se skala odgovarajućih minimalnih inhibitornih koncentracija (MIC). E-testovi vam omogućavaju da odredite minimalnu inhibitornu koncentraciju antimikrobnog lijeka (metoda kvantitativne difuzije).
. Inokulirajte ploču kulturom mikroorganizma.
. Stavite Etest® trake (do 2 po standardnoj šolji prečnika 90 mm ili do 6 po šoljici prečnika 180 mm).
. Tokom procesa uzgoja, oko trake će se formirati elipsoidna zona inhibicije rasta, koja siječe traku u tački koja odgovara MIC-u.
. E-testovi se koriste više od 20 godina.
. Više od 100 antimikrobnih lijekova.
. Trake za otkrivanje rezistencije na više lijekova.
. Određivanje osjetljivosti izbirljivih mikroorganizama, streptokoka, anaerobnih mikroorganizama, gljivica (uključujući plijesni), mikobakterija tuberkuloze itd.
. Pogodan oblik oslobađanja: 30 ili 100 komada, u blister pakovanju ili pjenastom ulošku.
| Kataloški broj | |||||
| Pojedinac paket |
Penasti uložak (temperatura skladištenja +20°S / +4°S) |
(temperatura skladištenja -20°C) |
|||
| Ime | 30 traka | 100 traka | 30 traka | 100 traka | 30 traka |
| Antifungalni | |||||
| E-test Amfotericin | 526318 | 526310 | |||
| E-test Anidulafungin | 532008 | 532000 | |||
| E-test Vorikonazol | 532818 | 532810 | |||
| E-test Itrakonazol | 412380 | 525818 | 525810 | ||
| E-test Kaspofungin | 412269 | 532418 | 532410 | ||
| E-test Ketokonazol | 525918 | 525910 | |||
| E-test Micafungin | 535708 | 535700 | |||
| E-test Posaconazole | 532118 | 532110 | |||
| E-test Flukonazol | 412350 | 510818 | 510810 | ||
| E-test Flucitozin | 510918 | 510910 | |||
| Antituberkuloza | |||||
| E-test Isoniazid | 527900 | ||||
| E-test Ethambutol | 527700 | ||||
| E-test Etionamid | 527500 | ||||
| Antibakterijski | |||||
| E-test Azitromicin | 412251 | 501618 | |||
| E-test Aztreonam | 412259 | 501718 | 501710 | ||
| E-test Amikacin | 412219 | 501318 | |||
| E-test Amoksicilin | 412243 | 500918 | |||
| E-test Amoksicilin/klavulanska kiselina (2/1) | 412241 | 501018 | 501010 | ||
| E-test ampicilin | 412253 | 501518 | |||
| E-test ampicilin/sulbaktam (2/1) | 412251* | 501818 | 501810 | ||
| E-test Bacitracin | 528608 | 528600 | |||
| E-test benzilpenicilin (visoke koncentracije) | 412263 | 502518 | |||
| E-test benzilpenicilin (niska koncentracija) | 412265 | 502618 | |||
| E-test Vankomicin | 412488 | 525518 | |||
| E-test Gatifloksacin | 530218 | 530210 | |||
| E-test Gentamicin (visoka koncentracija) | 512708 | 512700 | |||
| E-test Gentamicin (niska koncentracija) | 412368 | 512518 | |||
| E-test Daptomicin | 412324 | 535018 | 535010 | ||
| E-test doksiciklin | 412328*** | 509718 | 509710 | ||
| E-test Doripenem | 412326*** | 535918 | 535910 | ||
| E-test Imipenem | 412374 | 513618 | |||
| E-test Kanamicin | 527818 | 527810 | |||
| E-test Klaritromicin | 508718 | 508710 | |||
| E-test Clindamycin | 412315 | 509518 | |||
| E-test Colistin | 412317** | 537308 | 537300 | ||
| E-test Levofloksacin | 412393 | 527418 | |||
| E-test Linezolid | 412396 | 531318 | |||
| E-test Meropenem | 412402 | 513818 | |||
| E-test Metronidazol | 412404 | 530018 | |||
| E-test Mecillinam | 513708 | 513700 | |||
| E-test Minociklin | 412409*** | 516018 | 516010 | ||
| E-test Moksifloksacin | 412411** | 529018 | 529010 | ||
| E-test Mupirocin | 412417*** | 413496 | 516300 | ||
| E-test Nalidiksična kiselina | 516508 | 516500 | |||
| E-test Netilmicin | 517518 | 517510 | |||
| E-test Nitrofurantoin | 412426*** | 530408 | 530400 | ||
| E-test Norfloclacin | 412428** | 519508 | 519500 | ||
| E-test Oxacillin | 412432 | 520518 | |||
| E-test Ofloksacin | 519618 | 519610 | |||
| E-test Piperacilin | 521518 | 521510 | |||
| E-test Piperacilin/tazobaktam (4µg/ml) | 412434 | 521418 | |||
| E-test Polimiksin | 533408 | 533400 | |||
| E-test Rifampicin | 412450 | 526018 | 526010 | ||
| E-test Spectinomycin | 529218 | 529210 | |||
| E-test Streptomicin | 412454 | 526808 | 526800 | ||
| E-test Sulfametoksazol | 534118 | 534110 | |||
| E-test Teicoplanin | 412461 | 522018 | |||
| E-test Tetraciklin | 412471 | 522518 | |||
| E-test Tigeciklin | 412475 | 533518 | |||
| E-test Tikarcilin/klavulanska kiselina | 522618 | 522610 | |||
| E-test tobramicin (visoka koncentracija) | 533108 | 533100 | |||
| E-test tobramicin (niska koncentracija) | 522718 | 522710 | |||
| Trimetoprim E-test | 523618 | 523610 | |||
| E-test Trimetoprim/sulfametoksazol (1/16) | 412481 | 524418 | |||
| E-test Fosfomicin | 529108 | 529100 | |||
| E-test Fusidinska kiselina | 511518 | 511510 | |||
| E-test Quinupristin/dalfopristin | 528718 | 528710 | |||
| E-test Hloramfenikol | 412309 | 507518 | 507510 | ||
| E-test Cefaclor | 504518 | 504510 | |||
| E-test Cephalothin | 412307 | 503518 | 503510 | ||
| E-test Cefepime | 412273 | 505018 | 505010 | ||
| E-test Cefixime | 412275 | 529918 | 529910 | ||
| E-test Cefoxitin | 412285 | 506518 | 506510 | ||
| E-test Cefoperazon/sulbaktam (2/1) | 529318 | 529310 | |||
| E-test Cefotaksim (visoka koncentracija) | 412279 | 505518 | |||
| E-test Cefotaksim (niska koncentracija) | 412281 | 505618 | |||
| E-test Cefotetan | 506308 | 506300 | |||
| E-test sa Cefpirom | 506408 | 506400 | |||
| E-test Cefpodoksim | 505818 | 505810 | |||
| E-test Ceftazidim | 412293 | 506718 | |||
| E-test Ceftaroline | 412291 | ||||
| E-test Ceftizoxime | 527308 | 527300 | |||
| E-test Ceftobiprole | 412297 | ||||
| E-test Ceftriakson (visoka koncentracija) | 412301 | 506618 | 506700 | ||
| E-test Ceftriakson (niska koncentracija) | 412303 | 507018 | 507000 | ||
| E-test Cefuroksim | 506918 | 506910 | |||
| E-test Ciprofloksacin | 412311 | 508618 | |||
| E-test Enrofloksacin | 528908 | 528900 | |||
| E-test Eritromicin | 412334 | 510518 | |||
| E-test Ertapenem | 412332 | 531618 | 531610 | ||
| Broj po katalog |
|||
| Pojedinac paket |
Plastično pakovanje u presjeku (temperatura skladištenja -20°C) |
||
| Ime | 30 traka | 100 traka | 30 traka |
| Određivanje rezistencije na više lijekova | |||
| E-test Cefotaksim / Cefotaksim + klavulanska kiselina (4 μg/ml) |
412336** | 532208 | 532200 |
| E-test Ceftazidim / Ceftazidim + klavulanska kiselina (4 μg/ml) Dizajniran da odredi prisustvo enzima beta-laktamaze proširenog spektra (ESBL) inhibiranih klavulanskom kiselinom u gram-negativnim bakterijama, uključujući Klebsiella spp., Escherichia coli, Proteus mirabilis, druge članove porodice Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa |
412340** | 532508 | 532500 |
| E-test Cefepim / Cefepim + klavulanska kiselina (4 μg/ml) Dizajniran da odredi prisustvo enzima beta-laktamaze proširenog spektra (ESBL) inhibiranih klavulanskom kiselinom u gram-negativnim bakterijama, uključujući Klebsiella spp., Escherichia coli, Proteus mirabilis, druge članove porodice Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa |
412338** | 534708 | 534700 |
| E-test Imipenem / Imipenem + EDTA Dizajniran da odredi prisustvo enzima metalo-beta-laktamaze u gram-negativnim bakterijama, uključujući Pseudomonas spp., Acinetobacter spp. | 534208 | 534200 | |
| E-test Vankomicin / Teikoplanin Dizajniran za određivanje rezistencije (ili umjerene rezistencije) na glikopeptide gram-pozitivnih bakterija, uključujući Staphylococcus aureus, Enterococcus spp. |
537208 | 537200 | |
| E-test Cefotetan / Cefotetan + klaksacilin Dizajniran da odredi prisustvo enzima AmpC-beta-laktamaze u gram-negativnim bakterijama |
537108 | 537100 | |
U ovom dijelu ćemo se osvrnuti na end-to-end (E2E) testiranje: testirat ćemo cijelu aplikaciju, i to ćemo učiniti sa stanovišta korisnika, u suštini automatizirajući sve njegove radnje.
U našem slučaju, aplikacija se sastoji samo od frontenda - jednostavno nema backenda, pa će se E2E testiranje sastojati od otvaranja aplikacije u pravom pretraživaču, izvođenja skupa proračuna i provjere ispravnosti vrijednosti na ekranu.
Trebamo li provjeriti sve permutacije kao što smo radili u jediničnim testovima? Ne, jer je ovo već potvrđeno! U E2E testovima ne provjeravamo performanse pojedinačnih jedinica, već cijelog sistema odjednom.
Koliko E2E testova je potrebno?
Prvi razlog zašto takvih testova ne bi trebalo biti mnogo je taj što bi dobro napisana integracija i jedinični testovi trebali biti dovoljni. E2E testovi moraju potvrditi da su svi elementi ispravno međusobno povezani.
Drugi razlog je taj što su spori. Ako ih ima stotinu, kao što su testovi jedinica i integracije, onda će se testiranje održati Veoma dugo vremena.
Treći razlog je nepredvidivo ponašanje E2E testova. Postoji objava o ovom fenomenu na Googleovom blogu za testiranje. Jedinični testovi ne pokazuju ovakvu vrstu nestabilnog ponašanja. Mogu proći ili pasti - i to bez vidljivih promjena, isključivo zbog I/O. Da li je moguće ukloniti nepredvidljivost? Ne, ali možete ga minimizirati.
Da biste eliminirali nepredvidljivost, uradite što je moguće manje E2E testova. Napišite jedan E2E test za deset drugih, i to samo kada su zaista neophodni.
Pisanje E2E testova
Pređimo na pisanje E2E testova. Potrebne su nam dvije stvari: pretraživač i server za naš frontend kod.
Prvo, pogledajmo postavljanje web servera.
Postavljanje web servera u Mocha
Web server na Nodeu? Express odmah pada na pamet, pogledajmo kod:
Pusti server prije((done) => ( const app = express() app.use("/", express.static(path.resolve(__dirname, "../../dist"))) server = app. slušaj(8080, gotovo) )) after(() => ( server.close() ))
U prije funkciji kreiramo ekspresnu aplikaciju, usmjeravamo je na dist folder i postavljamo je da sluša na portu 8080. U funkciji after "ubijamo" server.
Dist folder je mjesto gdje pohranjujemo naše JS skripte i gdje kopiramo naše HTML i CSS datoteke. Možete vidjeti da to radimo u npm build skripti u package.json:
( "name": "frontend-testing", "scripts": ( "build": "webpack && cp public/* dist", "test": "mocha "test/**/test-*.js" && eslint test lib", ... ),
To znači da za E2E testove morate prvo pokrenuti npm run build, a zatim npm test. Da, nezgodno je. U slučaju jediničnih testova, to nije neophodno, jer se oni pokreću pod čvorom i ne zahtevaju prevod i sklapanje.
Radi potpunosti, pogledajmo webpack.config.js, koji opisuje kako bi Webpack trebao napraviti izgradnju datoteka:
Module.exports = ( unos: "./lib/app.js", izlaz: ( ime datoteke: "bundle.js", putanja: path.resolve(__dirname, "dist")), ... )
Dist folder se koristi i u korisničkom okruženju i u E2E testovima. Ovo je važno - E2E testove morate izvoditi u okruženjima koja su što sličnija onim „borbenim“.
Postavke pretraživača u Mocha
Naša aplikacija je instalirana na serveru - ostaje samo da pokrenete pretraživač za nju. Koju biblioteku ćemo koristiti za automatizaciju? Obično koristim popularni selen-webdriver.
Prvo, pogledajmo kako ga koristimo prije nego što uđemo u postavke:
Const (prepareDriver, cleanupDriver) = require("../utils/browser-automation") //... describe("calculator app", function () ( neka drajver ... prije (async () => ( driver = await readyDriver() )) after(() => cleanupDriver(driver)) it("trebalo bi raditi", async funkcija () (await driver.get("http://localhost:8080") //... )))
U funkciji prije pripremamo drajver, au funkciji poslije ga čistimo. Priprema drajvera će pokrenuti pretraživač, a brisanje će ga zatvoriti. Imajte na umu da se podešavanje drajvera odvija asinhrono i možemo koristiti async/await da učinimo kod ljepšim.
U test funkciji otvaramo adresu http://localhost:8080, ponovo koristeći await, s obzirom da je driver.get asinhrona funkcija.
Dakle, kako izgledaju readyDriver i cleanupDriver?
Const webdriver = require("selenium-webdriver") const chromeDriver = require("chromedriver") const path = require("path") const chromeDriverPathAddition = `:$(path.dirname(chromeDriver.path))` exports.prepareDriver = async () => ( process.on("beforeExit", () => this.browser && this.browser.quit()) process.env.PATH += chromeDriverPathAddition povratak čekaj novi webdriver.Builder() .disableEnvironmentOverrides() .forBrowser("chrome") .setLoggingPrefs((preglednik: "ALL", drajver: "ALL")) .build() ) exports.cleanupDriver = async (driver) => ( if (driver) ( driver.quit() ) process.env.PATH = process.env.PATH.replace(chromeDriverPathAddition, "") )
Ovo je komplikovana stvar. I moram nešto priznati: ovaj kod je napisan krvlju (oh, i radi samo na Unix sistemima). Napisana je koristeći Google, Stack Overflow i webdriver dokumentaciju i uvelike modificirana naučnim zabadanjem. Ali radi!
U teoriji, možete jednostavno kopirati i zalijepiti kod u svoje testove bez razumijevanja, ali pogledajmo ga na trenutak.
Prva dva reda povezuju webdriver - drajver za pretraživač. Način na koji Selenium Webdriver radi je da ima API (u modulu selen-webdriver koji uvozimo na liniji 1) koji radi sa bilo kojim pretraživačem i oslanja se na upravljačke programe pretraživača da... upravlja različitim pretraživačima. Drajver koji sam koristio je chromedriver, uvezen na liniji 2.
Chrome drajveru nije potreban pretraživač na mašini: on zapravo instalira sopstvenu izvršnu datoteku Chrome fajl kada uradite npm install . Nažalost, iz nekog razloga ne mogu da shvatim, ne može da ga pronađe i direktorijum chromedriver treba dodati u PATH (to je upravo ono što ne radi na Windows-u). Ovo radimo na redu 9. Takođe ga uklanjamo iz PATH tokom koraka čišćenja, na liniji 22.
Dakle, konfigurisali smo drajver pretraživača. Sada je vrijeme da konfigurišemo (i vratimo) web drajver, što radimo na redovima 11-15. A pošto je funkcija izgradnje asinhrona i vraća se, čekamo je koristeći await.
Zašto to radimo u redovima 11–15? Razlozi se kriju u magli iskustva. Slobodno kopirajte i zalijepite - nema garancija, ali koristim ovaj kod neko vrijeme bez problema.
Počnimo sa testiranjem
Završili smo sa podešavanjem – vreme je da pogledamo kod koji webdriver koristi za kontrolu pretraživača i testiramo naš kod.
Klasifikacija, opšti pristupi implementaciji. Metode difuzije: metoda papirnog diska, E-test.Metode za određivanje osjetljivosti bakterija na antibiotike dijele se u 2 grupe:
1. Metode difuzije:
. korišćenje diskova sa antibiotikom
. korištenjem E-testova
2. Metode serijskog razrjeđivanja:
. razrjeđivanje u tečnom hranljivom mediju (čorba)
. razblaživanje u agar podlozi
Metode za određivanje osjetljivosti razvijene su u drugoj polovini 60-ih - ranih 70-ih godina 20. stoljeća i od tada nisu pretrpjele suštinske promjene sa metodološke tačke gledišta.
Sljedeći koraci su zajednički za sve metode:
- priprema i kontrola kvaliteta hranljivih podloga
- priprema suspenzije test mikroorganizama (inokuluma)
- inokulacija
- za difuzijske metode - faza nanošenja E-test diskova ili traka na čvrstu hranjivu podlogu.
- inkubacija
- snimanje i interpretacija rezultata
- formulisanje preporuka za tretman
Metode difuzije baziraju se na difuziji antibakterijskog lijeka (ABP) iz nosača u čvrstu hranjivu podlogu inokuliranu mikroorganizmom i evidentiranju promjera zone inhibicije (kašnjenja) rasta mikroorganizma koji se proučava.
. Metoda je manje osjetljiva i manje precizna od metode serijskog razrjeđivanja, ali se češće koristi u praksi zbog svoje jednostavnosti. Objavljeno na ref.rf.
. Brzina difuzije bilo kojeg lijeka u agar ovisi o njegovoj strukturi, molekularnoj težini, prisutnosti nečistoća, sastavu i pH podloge.
Metoda papirnih diskova sa antibiotikom (metoda disk difuzije).
. Za izvođenje ove metode koristite standardni točkovi, koji sadrži određenu količinu antibiotika, i standardni hranljivi medij neophodan za rast ove vrste mikroorganizama. U određenim granicama, prečnik zone inhibicije rasta je obrnuto proporcionalan MIC-u. . Bakterijska suspenzija određene gustine nanosi se na površinu agara u Petrijevoj posudi. . Stavljaju se diskovi koji sadrže određenu količinu antibiotika. . Inkubirajte u uslovima pogodnim za svaki specifičan mikroorganizam. . Prečnici zona inhibicije rasta oko diska mjere se u milimetrima (uzimajući u obzir prečnik diska). . Rezultat se procjenjuje pomoću posebne tablice upoređivanjem promjera zona inhibicije rasta ispitivanog usjeva s graničnim vrijednostima promjera zone u tabeli. . Kultura koja se proučava klasifikovana je u jednu od tri kategorije: osjetljiva, umjereno osjetljiva i otporna. 
E-test (E-test ili epsilometrijska metoda)
Metoda je po tehnologiji bliska metodi papirnog diska.
. Kao nosač se koristi uska traka polimera (0,5x6,0 cm), na koju se nanosi gradijent koncentracija ABP (od minimalne do maksimalne). Vrijednosti koncentracije ABP u svakom dijelu trake označene su na vanjskoj (okrenutoj prema istraživaču) površini.
. Do inhibicije rasta mikroorganizama oko trake nosača dolazi u zoni u kojoj je koncentracija antibiotika koji difundira iz nosača veća od MIC.
. Na preseku elipsoidne zone inhibicije rasta sa E-test trakom, dobija se MIC vrednost.
E-test kombinuje jednostavnost metode papirnog diska sa preciznošću metode serijskog razblaživanja. 
Metode korišćene za uporednu in vitro procenu lekova za antimikrobnu terapiju: metoda serijskih razblaženja u tečnim i čvrstim hranljivim medijima.
Metode serijskog razrjeđivanja:
. Oni omogućavaju kvantificiranje osjetljivosti izolovanog mikroorganizma na antibakterijske agense i određivanje MIC lijeka.
. Koristi se za uporednu procjenu in vitro antimikrobne aktivnosti generičkog lijeka u razvoju i originalnog lijeka.
. Da bi se odredila MIC vrijednost, određene koncentracije antibiotika se dodaju u hranljivu podlogu, koja se zatim inokulira kulturom mikroorganizma koji se proučava. Nakon inkubacije, procjenjuje se prisustvo ili odsustvo vidljivog rasta.
. Na osnovu upotrebe dvostrukih serijskih razrjeđenja koncentracija ABP od maksimalne do minimalne (na primjer, od 128 μg/ml, 64 μg/ml, itd. do 0,5 μg/ml, 0,25 μg/ml i 0,125 μg/ml ) .
. Izvode se u tečnim i agar hranljivim medijima. Metoda serijskih razblaženja u tečnom hranljivom mediju (čorba)
Postoje 2 opcije za ovu metodu:
makrometoda (epruveta) i mikrometoda (ploča).
Makro metoda.
. Ispitivanje se vrši u epruvetama u konačnoj zapremini od 1 ml za svako razblaživanje.
. Hranjivi bujon se sipa u 0,5 ml u svaku epruvetu. Broj epruveta je određen potrebnim opsegom razblaženja ABP.
. Priprema suspenzije ispitivanih mikroorganizama:
- Radna suspenzija (~ 10 6 CFU/ml) se priprema od standardne suspenzije svakog ispitivanog mikroorganizma (~ 10 8 CFU/ml). Priprema dvostrukih serijskih razrjeđenja ABP: - pripremiti osnovni rastvor ABP ispitivanog generičkog lijeka i referentnog lijeka (originalnog) u koncentraciji od 1000 μg/ml i više (uzimajući u obzir sadržaj aktivne tvari) . - od osnovnih rastvora ABP generičkog leka koji se proučava i referentnog leka (original) pripremaju se radni rastvori ABP korišćenjem tečnog hranljivog medijuma. (Koncentracija radnih rastvora se izračunava na osnovu zahtevane maksimalne koncentracije u nizu serijskih razblaženja, uzimajući u obzir faktor razblaženja tokom naknadne inokulacije suspenzijom mikroorganizma) - pripremaju se serijska razblaženja: 0,5 ml radnog rastvora ABP se dodaje u prvu epruvetu koja sadrži 0,5 ml bujona. Stir. Novom pipetom (vrhom) prebacite 0,5 ml otopine ABP u juhi u drugu epruvetu koja sadrži 0,5 ml juhe, itd., dok se ne sve potreban red razblaženja. Iz posljednje epruvete se uklanja 0,5 ml. Tako se dobija niz epruveta sa rastvorima ABP, čije se koncentracije u susednim epruvetama razlikuju 2 puta. Inokulacija: 0,5 ml mikrobne suspenzije sa koncentracijom mikroorganizama od ~ 10 6 dodaje se u svaku epruvetu sa 0,5 ml odgovarajućeg razblaženja ABP. Konačna koncentracija mikroorganizma u svakoj epruveti je ~ 5x10 5 CFU/ml. . Kontrola - epruveta sa bujonom i kulturom mikroorganizama (kontrola rasta). Negativna kontrola - epruveta sa bujonom (kontrola steriliteta). . Inkubacija: Sve epruvete, zatvorene čepovima ili poklopcima, inkubiraju se u uslovima koji obezbeđuju rast test mikroorganizama. . Snimanje i interpretacija rezultata: epruvete sa kulturama se posmatraju u propuštenom svetlu. Rast kulture u epruveti sa ABP upoređuje se sa kontrolnom epruvetom. - prisustvo rasta mikroorganizama u bujonu (zamućenje bujona) ukazuje na to da je ova koncentracija antibiotika nedovoljna za suzbijanje njegove vitalnosti. - kako se koncentracija antibiotika povećava, rast mikroorganizma se pogoršava. Prva najniža koncentracija antibiotika (iz serije serijskih razrjeđenja), gdje rast bakterija nije vizualno određen, smatra se minimalnom inhibitornom koncentracijom (MIC). lijekovi za antibakterijsku terapiju - usporedite rezultate dobivene za originalni lijek i generički lijek koji se proučava. Zaključuje se o njihovoj ekvivalenciji u pogledu spektra (lista korišćenih mikroorganizama) i stepena antimikrobne aktivnosti (vrednosti MIC). 
. Određivanje MBC: iz nekoliko zadnjih epruveta sa zaostalim rastom, inokulirati omčom na sektore Petrijeve posude. MBC, koji je obično nekoliko razblaženja manji od MIC, uzima se kao koncentracija lijeka u posljednjoj epruveti iz koje nije dobiven rast. . Nedostatak metode: niska produktivnost - primjena je ograničena na proučavanje malog broja mikroorganizama.
Mikrometoda
.Procedura testiranja je slična onoj kada se koristi makrometoda
Konačna zapremina je do 0,2 ml. Dostupnost odgovarajuće laboratorijske opreme: ploča sa 96 jažica sa sterilnim poklopcima, radni rastvori ABP se mogu unapred dodati u jažice, a zatim ih čuvati zatvoreni u polietilenu na temperaturi ispod 60°C do trenutka upotrebe. . Prednosti metode: - Visoke performanse- mogućnost dugotrajnog skladištenja unaprijed pripremljenih tableta - ušteda Zalihe. Objavljeno na ref.rf
Metoda serijskih razblaženja u agar podlozi. Princip ispitivanja je sličan metodi razrjeđivanja bujona. Priprema suspenzije test mikroorganizama: - standardna suspenzija svakog test mikroorganizma treba da sadrži ~ 10 8 CFU/ml. - standardna mikrobna suspenzija za eksperiment je razrijeđena ~ 10 puta kako bi se dobila koncentracija mikroorganizma od ~ 10 7 CFU/ml. Priprema dvostrukih serijskih razblaženja ABP za originalni lijek i generički lijek koji se ispituje vrši se slično metodi razrjeđenja u bujonu. Agar podloga se otopi i ohladi na temperaturu od 45-50°C. . Priprema posuda sa agar medijumom i razblaženjima ABP: pomešati agar medij i rastvore ABP direktno u Petrijevoj posudi (za plastične posude prečnika 90 mm dodati 18 ml rastopljenog i ohlađenog agara u 2 ml rastvora ABP). . Inokulacija i inkubacija: bakteriološka petlja se koristi za prijenos 1-2 μl suspenzije ispitivanih mikroorganizama na površinu agar podloge. Dakle, konačna doza inokuluma je ~10 4 CFU (standardna bakteriološka petlja prečnika 3 mm nosi 1-2 µl tečnosti). . Na površini agara formira se mrlja prečnika 5-8 mm. Nakon sušenja posude se okreću i inkubiraju u uslovima povoljnim za rast ispitivanih mikroorganizama. . Snimanje i interpretacija rezultata: slično metodi razblaživanja bujona. Petrijeve zdjelice se postavljaju na tamnu, nereflektirajuću površinu. Koncentracija ABP koja je izazvala potpunu inhibiciju vidljivog rasta uzima se kao MIC. . Kontrola: agar ploče inokulirane suspenzijom kultura mikroorganizama bez ABP (kontrola rasta). Negativna kontrola: agar ploče (kontrola steriliteta). Prednosti metode: na jednoj ploči može se odrediti osjetljivost nekoliko mikroorganizama.
Opseg istraživanja uporedne procjene in vitro antimikrobne aktivnosti za generička i originalna antimikrobna sredstva.
Opseg istraživanja uporedne procjene in vitro antimikrobne aktivnosti generičkih antimikrobnih lijekova:
.Cilj studije: potvrda usklađenosti generičkog lijeka sa referentnim (originalnim) u pogledu spektra (mikroorganizmi) i stepena (MIC, MBC vrijednost) antimikrobne aktivnosti.
.Skup testiranih mikroorganizama: 1-2 soja svakog mikroorganizma uključenog u spektar djelovanja
- referentni kolekcioni sojevi
- klinički sojevi izolovani u bolnicama
.Određene su vrijednosti MIC-a i MBC-a
.Kontrola: referentni lijek - originalni lijek
.Očekivani rezultat: MIC i MBC razvijenih generičkih antimikrobnih lijekova su u prihvatljivim rasponima vrijednosti i potpuno se poklapaju sa MIC i MBC referentnih lijekova (originalnih lijekova) u odnosu na sakupljanje i kliničke sojeve.
Postupak ispitivanja za određivanje in vitro antimikrobne aktivnosti novih antimikrobnih jedinjenja:
.Primarna procjena osjetljivosti na nova jedinjenja referentnih sojeva različitih tipova gram-negativnih i gram-pozitivnih mikroorganizama (4-5 sojeva za svaku vrstu);
.Detaljno proučavanje stepena antibakterijske aktivnosti jedinjenja protiv sojeva gram-negativnih i gram-pozitivnih mikroorganizama iz međunarodnih kolekcija sa poznatim mehanizmima rezistencije (metoda serijskog razblaživanja);
.Proučavanje aktivnosti protiv kliničkih sojeva oportunističkih i patogenih mikroorganizama u poređenju sa poznatim lijekovima slične hemijske grupe ili sličnih po antimikrobnom djelovanju:
- u slučaju preovlađujuće aktivnosti protiv gram-pozitivnih mikroorganizama, kontrola - prirodni penicilini, cefalosporini prve i druge generacije, makrolidi, linkozamidi; - za aktivnost protiv gram-negativnih mikroorganizama, kontrola - polimiksin B, aztreonam; - za lijekove širokog spektra, kontrola - polusintetski penicilini, aminoglikozidi, tetraciklini, cefalosporini III - IV generacije
. Procjena antimikrobnog djelovanja na problematične patogene: stafilokoke rezistentne na meticilin, streptococcus pneumonia rezistentne na benzilpenicilin, enterobakterije rezistentne na više lijekova, bakterije roda Pseudomonas rezistentne na aminoglikozide itd.
.Početne terapijske koncentracije novih lijekova utvrđuju se uzimajući u obzir toksičnost utvrđenu u eksperimentima proučavanja akutne toksičnosti;
. Uporedni stepen antibakterijske aktivnosti lijekova procjenjuje se MIC ili MBC vrijednosti, određene na najmanje 2 vrijednosti doze sjemena: minimalna - 10 4 - 10 5 CFU/ml i maksimalna - 10 6 - 10 9 CFU /ml, u zavisnosti od vrste patogena; Do danas ne postoje metode koje bi nam omogućile da sa apsolutnom sigurnošću predvidimo klinički učinak antibiotika u liječenju zaraznih bolesti. Međutim, ovi rezultati osjetljivosti mogu poslužiti kao dobar vodič za kliničare da odaberu i prilagode antibakterijsku terapiju.
Sadržaj knjige otvori zatvori
1. Farmaceutska mikrobiologija. Predmet i zadaci farmaceutske mikrobiologije.
2. Farmacija i farmacija: istorijat nastanka i razvoja.
3. Medicina: definicija, klasifikacija.
4. Sastav lijekova | farmaceutska supstanca, pomoćna tvar.
5. Originalni i generički lijekovi. Naziv lekova.
10. Djelovanje štetnih faktora na mikroorganizme. Utjecaj temperaturnog faktora i njegova primjena u farmaciji.
11. Utjecaj zračenja na mikroorganizme, vrste zračenja.
12. Utjecaj hemijskih štetnih faktora na mikroorganizme
13. Sterilizacija. Nivo osiguranja sterilnosti (SAL). Kriterijumi za odabir metode sterilizacije.
14. Termička i hemijska sterilizacija
15. Praćenje efikasnosti uređaja za sterilizaciju.
16. Industrijska dezinfekcija
17. Sredstva za dezinfekciju i antiseptici. Zahtjevi za hemijska dezinficijensa i antiseptike.
18. Konzervansi i njihova upotreba u farmaceutskoj proizvodnji
