Disko difuzijos metodas
Ant tankios maistinės terpės, pasėtos virš ištisinės vejos su tiriamu pasėliu, paviršiaus dedami ne daugiau kaip 6 antibiotikais impregnuoti diskai, vienas nuo kito ne mažesniu kaip 2 cm atstumu. Rezultatai registruojami po 18-24 valandų inkubacijos termostate pagal neaugimo zonos aplink diskus su antibiotikais skersmenį. Augimas aplink diską rodo šio mikrobo nejautrumą antibiotikams. Rezultatams interpretuoti naudojamos specialios lentelės.
1 pav. Jautrumo nustatymas
mikroorganizmai naudojant disko difuzijos metodą:
1 – mikroorganizmas jautrusį antibiotiką;
2 – mikroorganizmas vidutiniškai atsparusį antibiotiką;
3 – mikroorganizmas stabilusį antibiotiką.
E-testo metodas
Metodo principas. Mikroorganizmo jautrumo nustatymas atliekamas panašiai kaip bandymas disko difuzijos metodu. Skirtumas tas, kad vietoj antibiotikų disko naudojama E-testo juostelė, kurioje yra antibiotikų koncentracijos gradientas nuo didžiausios iki minimalios. Elipsoidinės augimo slopinimo zonos sankirtoje su E-testo juostele gaunama minimalios slopinančios koncentracijos (MIC) reikšmė.
2 pav. Mikroorganizmų jautrumo nustatymas naudojant E-testus
Serijinio skiedimo sultinio terpėje metodas
Mėgintuvėliuose, kuriuose yra 1 ml Mueller-Hinton sultinio, paruoškite antibakterinio vaisto du kartus praskiedimus, pavyzdžiui, 100 µg/ml – 1, 50 µg/ml – 2, 25 µg/ml – 3, 12,5 µg/ml. – 4 ir kt. Tada į kiekvieną mėgintuvėlį įpilama 0,1 ml tiriamos bakterijų suspensijos. Tuo pačiu metu skiriamas augimo kontrolė (1 ml Mueller-Hinton sultinio ir 0,1 ml bakterijų suspensijos). Pasėliai inkubuojami 37°C temperatūroje 18-24 valandas, po to pažymimi rezultatai. Drumstumo nebuvimas terpėje rodo, kad esant tam tikrai vaisto koncentracijai sulėtėja bakterijų augimas.
3 pav. MIC reikšmės nustatymas praskiedus skystoje maistinėje terpėje
Minimali slopinanti koncentracija (MIK) – tai mažiausia antibiotiko koncentracija (μg/ml arba mg/l), kuri visiškai slopina matomą bakterijų augimą in vitro.
2 Skirtingų stafilokokų padermių jautrumo antibiotikams nustatymas standartiniu disko metodu
|
Antibiotikas |
Augimo slopinimo zona, mm |
Įtempimo charakteristikos |
Tiriama kultūra jautri _______________________________________________________
vidutiniškai atsparus _____________________________________________________________________________,
atsparus _________________________________________________________________________________.
3 Penicilino minimalios slopinančios koncentracijos (MIK) nustatymas serijinių skiedimų metodu.
Išvada: Penicilino MIC tiriamai padermei yra __________________________________________
Metodo privalumai:_________________________________________________________________________________
Metodo trūkumai:______________________________________________________________________________________
4 Įvairių tipų bakterijų antagonistinio poveikio identifikavimas ir registravimas.
Ant lėkštelės su MPA užsėjamas antagonistinis mikrobas ir jam statmenos tiriamosios padermės. Rezultatai registruojami praėjus vienai dienai po sėjos. Antagonistinio poveikio buvimas ir laipsnis nustatomas pagal tiriamųjų kultūrų augimo slopinimo zonų dydį.
Linijinė sėja________________________________________
Išvada: didžiausias antagonistinis poveikis nustatytas bandomoms padermėms (nurodyti rūšis) __________________________________________________________________________________________________________
PAMOKA Nr.8
SUBJEKTAS: BAIGIAMOJI PAMOKA TEMA: „MIKROBIOLOGIJOS, MORFOLOGIJOS, FIZIOLOGIJOS IR GENETIKOS MIKROORGANIZMŲ RAIDOS ISTORIJOS ETAPAI“.
Tikrųjų bakterijų formos ir dydžiai. Tikrųjų bakterijų sferinių, lazdelės formos ir vingiuotų formų charakteristikos.
Bakterijų struktūra. Pagrindiniai skirtumai tarp prokariotinės ir eukariotinės ląstelės.
Gramteigiamų ir gramneigiamų bakterijų ląstelių sienelė.
Mikroskopinių preparatų rūšys. Fiksuotų preparatų ruošimo technika.
Mikroskopijos šviesos mikroskopu technika. Mikroorganizmų morfologijos tyrimas elektroniniu mikroskopu.
Tintorinės mikrobų savybės. Dažikliai. Paprasti fiksuotų preparatų dažymo būdai.
Patogeninių prokariotų klasifikavimo principai (Burgee, 2001).
Apsauginės priemonės mikroorganizmuose. Sporos, sporų susidarymo stadijos ir sąlygos, biologinė reikšmė.
Bakterinės kapsulės, jų reikšmė.
Vėliavos, jų sandara. Cilia. Sekso gėrimas.
Sudėtingi dažymo būdai. Gram, Ziehl-Neelsen, Burri-Gins, Neisser dažymo metodai.
Gyvoje būsenoje esančių mikroorganizmų tyrimo metodai. Konkursas. Metodo principas.
Spirochetes. Sisteminė spirochetų padėtis ir morfologija. Ultrastruktūros ir cheminės sudėties ypatumai. Tyrimo metodai.
Aktinomicetai, morfologija, ultrastruktūra, cheminė sudėtis. Patogeninės rūšys. Aktinomicetų vaidmuo gamtoje ir medicinoje. Aptikimo metodai.
Chlamidijų taksonomija. Morfologija, struktūra, aptikimo metodai. Chlamidijų vystymosi ciklas.
Riketija, morfologija, ultrastruktūra, cheminė sudėtis. Patogeninės rūšys.
Mikoplazmos. Klasifikacija. Filogenezė. Aptikimo metodai.
Defektinės mikrobų formos: protoplastai, sferoplastai, L formos.
Bakterijų mityba. Maisto medžiagos yra anglies ir azoto šaltiniai. Bakterijų klasifikacija pagal mitybos tipą Autotrofai ir chemoorganotrofai
Augimo veiksniai ir jų šaltiniai. Mineralinių elementų šaltiniai.
Maistinių medžiagų pernešimo per membraną metodai ir mechanizmai.
Bakterijų energijos poreikis. Energijos gavimo iš autotrofų būdai (fotosintezė, chemosintezė). Energijos gavimo chemoorganotrofuose šaltiniai ir būdai.
Aerobinis ir anaerobinis biologinės oksidacijos tipai bakterijose. Aerobinės, anaerobinės, fakultatyvinės anaerobinės ir mikroaerofilinės bakterijos. Anaerobinių sąlygų sudarymo metodai.
Bakteriologinio (kultūrinio) tyrimo metodo tikslai, etapai, privalumai ir trūkumai.
Mikroorganizmų augimas ir dauginimasis. Dauginimosi būdai. Dvejetainis (paprastas) dalijimosi mechanizmas. Bakterijų populiacijų dauginimasis.
Bakterijų auginimo principai ir metodai. Mikrobų mitybos poreikiai.
Maistinė terpė bakterijoms auginti. Reikalavimai maistinėms terpėms. Maistinių terpių klasifikacija.
Bakterijų auginimo sąlygos ir būdai. Sėjos į maistines terpes technika. Bakterijų augimo kietose ir skystose maistinėse terpėse modeliai ir pobūdis.
Grynųjų aerobinių ir anaerobinių bakterijų kultūrų išskyrimo metodai.
Išskirtoms kultūroms identifikuoti naudojamų mikroorganizmų savybės.
Bakteriniai fermentai, klasifikacija. Mikroorganizmų biocheminių savybių tyrimo metodai. Praktinis biocheminio aktyvumo panaudojimas bakterijų identifikavimui
Sacharolitinių savybių, Hiss terpės sudėties nustatymas; proteolitinių savybių nustatymas, katalazės ir oksidazės aktyvumo nustatymas.
Automatinio bakterijų kultūrų identifikavimo prietaisų (hemokultivatoriaus, automatinio analizatoriaus) veikimo principas ir naudojimo ypatumai.
Riketsijų ir chlamidijų auginimo ypatybės.
Bakteriofagai (fagai). Atradimų istorija. Fagų morfologija, struktūriniai ypatumai, cheminė sudėtis ir savybės.
Virulentiški fagai. Sąveikos su bakterine ląstele fazės. Fago ir ląstelės sąveikos rezultatai. Vidutinio klimato fagai. Profagas. Lizogenijos reiškinys. Fagų konversija.
Bakteriofagų išskyrimo ir titravimo kietose ir skystose maistinėse terpėse metodai Fagų taikymas mikrobiologijoje ir medicinoje. Fagų diagnostika ir fagų tipavimas.
Paveldimumas. Genetinio aparato organizavimas bakterijose (nukleoidas, plazmidės, Is-sekos, transpozonai).
Bakterijų genomo veikimo principai. Operono organizavimas. Genotipas ir fenotipas.
Plazmidės, plazmidžių klasifikacija, struktūra ir savybės. R-plazmidė, struktūros ir funkcijos ypatumai. Bakteriocinogeninės plazmidės.
Mikrobų kintamumas. Bakterijų modifikacijos, reikšmė, pagrindinės apraiškos ir savybės (nepaveldimas pobūdis, prisitaikymas, didelis tiesioginių ir atvirkštinių pokyčių dažnis, daug skatinančių veiksnių).
Genotipinis kintamumas. Mutacijos ir jų klasifikacija. Mutagenai. Fenotipiniai mutacijų pasireiškimai. Mutantų likimas. Disociacija bakterijose. Atrankos įtaka. Genomo pažeidimų taisymo sistema.
Rekombinacijos kintamumas. Kombinuotų genomų susidarymo mechanizmai. Individualių savybių pokyčių dažnis. Transformacija, transdukcija, konjugacija.
Praktinė žinių apie mikrobų genetiką reikšmė. Genetinio kartografavimo principai.
Genetinės analizės metodai (molekulinė hibridizacija, polimerazės grandininė reakcija, blotavimas, sekvenavimas).
Genų inžinerijos samprata ir jos metodų panaudojimas mikrobiologijoje ir biotechnologijoje. Genetiškai modifikuotų vakcinų ir citokinų gamyba ir naudojimas.
Antimikrobinės priemonės. Aplinkos veiksnių įtaka mikrobams. Fizinių veiksnių (temperatūra, džiovinimas, radiacija, ultragarsas, osmosinis slėgis) veikimas. Cheminių veiksnių veikimas.
Sterilizacijos ir dezinfekcijos tikslai, metodai, priemonės ir objektai medicinos ir mikrobiologinėje praktikoje. Dezinfekcijos kokybės kontrolė. Sterilizacijos ir sterilumo kontrolė. Vykdymo būdai.
Antiseptikas. Apibrėžimas. Antiseptikai, reikalavimai, kilmė, savybės, grupės, mikrobų veikimo mechanizmai. Antiseptikų rūšys. Terapiniai antiseptikai. Prevenciniai antiseptikai.
Chemoterapiniai vaistai. Savybės. Pagrindinės chemoterapinių vaistų grupės. Bakterijų veikimo mechanizmai. Selektyvumo samprata ir veiksmo „tikslai“.
Antibiotikai. Apibrėžimas. Antibiotikų gamintojai. Sintetiniai ir pusiau sintetiniai antibiotikai.
Pagrindinės antibiotikų grupės pagal cheminę struktūrą. Beta laktaminiai antibiotikai Tetraciklinai. Aminoglikozidai. Makrolidai ir azolidai. Ansamicinai (rifampicinai). Levomicetinas. Fluorochinolonų grupės antibiotikai. Linkomicinas. Polimiksinai. Glikopeptidai
Antibiotikų klasifikacija pagal veikimo mechanizmą bakterijų ląstelėje.
Mikroorganizmų atsparumo antibakteriniams vaistams mechanizmai.
Bakterijų jautrumo antibiotikams ir kitiems chemoterapiniams vaistams nustatymo metodai. Jautrumo nustatymo, įrašymo ir įvertinimo disko metodu technika, E-testas, serijiniai skiedimai.
PAMOKA Nr.9
SUBJEKTAS: BAKTERIJŲ EKOLOGIJA. INFEKCIJA. PATOGENINIAI MIKROORGANIZMAI. MIKROBIŲ TOKSINAI. BIOLOGINIS (EKSPERIMENTINIS) METODAS.
KONTROLINIS SĄRAŠAS
Žmogaus kūno mikroflora . Normali (rezidento) žmogaus mikroflora. Autochtoninė ir alochtoninė, parietalinė ir šviesinė mikroflora. Normalios mikrofloros formavimasis ir vystymasis. Normalios mikrofloros funkcijos: antiinfekcinės, metabolinės, imunobiologinės, antitoksinės.
Dismikrobiocenozė (disbakteriozė), priežastys, rūšys, korekcijos principai.
Infekcijos samprata. Apibrėžimas, bendrosios charakteristikos. Skirtumai tarp infekcinių ir neinfekcinių ligų.
Mikroorganizmo vaidmuo infekciniame procese. Infekcinė dozė. Infekcijos būdai. Įėjimo vartai. Patogeniškumas ir virulentiškumas. Genetinė patogeniškumo ir virulentiškumo kontrolė. Veiksniai, didinantys ir mažinantys mikrobų virulentiškumą.
Patogeniškumo veiksniai. Virulentiškumo nustatymo metodai, vienetai. Privalomi patogeniniai ir sąlyginai patogeniški mikroorganizmai.
Mikroorganizmų toksiškumas ir toksiškumas. Endotoksinai, savybės, gamyba, taikymas. Egzotoksinai, savybės, gamyba, matavimo vienetai. Egzotoksinų rūšys, veikimo mechanizmas.
Makroorganizmo vaidmuo infekcinių ligų vystymuisi ir eigoje. Paveldimi veiksniai. Anatominė ir fiziologinė kūno būklė. Gyvenimo sąlygų vaidmuo infekcinių ligų vystymuisi ir eigai. Natūralūs veiksniai. Socialiniai veiksniai.
Infekcinių procesų klasifikavimas pagal sunkumą, patogeno pobūdį, infekcijos šaltinį, patogeno perdavimo būdą ir infekcijos mechanizmą bei paplitimą. Infekcinių procesų klasifikacija pagal mikrobų židinio lokalizaciją, eigos trukmę ir infekcijos dažnį.
Infekcinio proceso dinamika, jo ypatumai.
Biologinio (eksperimentinio) tyrimo metodas, etapai, vertinimas. Laboratoriniai gyvūnai. Infekcijos būdai.
LABORATORINIS DARBAS
1 Normalios mikrofloros tyrimas.
A) Sėja, norint ištirti normalią rankų odos mikroflorą ant Endo terpės ir kraujo agaro replikos metodas.
Metodo principas: sudrėkinkite sterilius 1x1 cm filtravimo popieriaus gabalus Petri lėkštelėje steriliu fiziologiniu tirpalu. sprendimas. Steriliu pincetu ant tiriamos odos paviršiaus uždėkite popieriaus lapą 0,5 minutės. Padėkite popierių ant tankios maistinės terpės paviršiaus (spausdinkite) 1 minutę. Nuimkite popierių. Lėkštes su atspaudais inkubuokite 37 0 C temperatūroje 24-48 valandas.
C) Atlikti mikrofloros inokuliacijos protokolą, paruošti preparatus iš skirtingų kolonijų tipų, Gramo dažų, mikroskopu (demonstracinėse inokuliacijose).
Mikrofloros inokuliacijos apskaita:
Preparatų mikroskopija:
|
Vaistas__________________ _______________________ Dažymas _______________ _______________________ |
Vaistas__________________ _______________________ Dažymas _______________ _______________________ |
2 Lipnumo įvertinimasE. colidėl jų gebėjimo adsorbuotis raudonųjų kraujo kūnelių paviršiuje
Metodo principas:Į eritrocitų suspensiją dedama tiriamoji mikroorganizmų kultūra. Po inkubacijos paruošiami tepinėliai, dažomi, mikroskopu nustatomas vidutinis ant vieno raudonojo kraujo kūnelio adsorbuotų bakterijų skaičius.
Šiuo atveju raudonieji kraujo kūneliai naudojami kaip pavyzdinė jautraus mikroorganizmo ląstelė.
3 Invazinių fermentų nustatymas stafilokokuose
1. Plazmokoagulazė
Metodo principas: Bandomoji kultūra įpilama į mėgintuvėlį, kuriame yra citratinės triušio kraujo plazmos. Po inkubacijos termostate atsižvelgiama į rezultatą. Jei rezultatas teigiamas, plazma kreša (koaguliuoja).
2.Fibrinolizinas
Metodo principas: tiriamoji kultūra dedama į mėgintuvėlį su fibrinu (kraujo krešuliu, išplautu iš raudonųjų kraujo kūnelių). Po inkubacijos termostate atsižvelgiama į rezultatą. Jei rezultatas teigiamas, krešulys ištirpsta.
3.Hialuronidazė
Metodo principas: tiriamoji kultūra įpilama į mėgintuvėlį su hialurono rūgštimi (HA). Po inkubacijos termostate pridedamas reagentas, sukeliantis HAA koaguliaciją, ir atsižvelgiama į rezultatą. Jei rezultatas teigiamas (dėl HAA skilimo), krešulio nesusidaro.
4.Lecitovitelazė (lecitinazė)
Metodo principas: išskirtos stafilokokų kultūros pasėjamos ant trynio-druskos agaro, kuriame yra 7,5 % natrio chlorido ir trynio suspensijos. Jei rezultatas teigiamas, dėl vištienos kiaušinio trynyje esančio lecitino skilimo aplink virulentiškų stafilokokų kolonijas susidaro vaivorykštės aureolė.
Išvada: (išvardykite kiekvienos iš dviejų tirtų padermių virulentiškumo fermentus) _____________________________________________________________________________________________________
_____________________________________________________________________________________________
Bakterijų toksinai
Toksiškumas __________________________________________________________________________________________
Toksiškumas ______________________________________________________________________________________
Endotoksinas ______________________________________________________________________________________
Endotoksinis šokas ___________________________________________________________________________
Praktinis endotoksinų pritaikymas:
Egzotoksinas _______________________________________________________________________________________
Anatoksinas __________________________________________________________________________________________
Egzotoksino ir toksoido gavimo schema.
1.____________________________________________________________________________________________
2.____________________________________________________________________________________________
4.____________________________________________________________________________________________
Praktinis toksoidų naudojimas:
1.____________________________________________________________________________________________
2.____________________________________________________________________________________________
3.____________________________________________________________________________________________
Paskaitoje aptariami pagrindiniai jautrumo nustatymo metodai in vitro mikroorganizmų į antimikrobinius vaistus (disko difuzija, E-testai, skiedimo metodai). Klinikinėje praktikoje atsispindi požiūriai į empirinį ir etiotropinį antibiotikų skyrimą. Aptariami jautrumo nustatymo rezultatų interpretavimo klinikiniu ir mikrobiologiniu požiūriu klausimai.
Šiuo metu klinikinėje praktikoje galioja du antibakterinių vaistų skyrimo principai: empirinis ir etiotropinis. Empirinis antibiotikų receptas remiantis žiniomis apie natūralų bakterijų jautrumą, epidemiologiniais duomenimis apie mikroorganizmų atsparumą regione ar ligoninėje, taip pat kontroliuojamų klinikinių tyrimų rezultatais. Neabejotinas empirinio chemoterapijos skyrimo pranašumas yra galimybė greitai pradėti gydymą. Be to, šis metodas pašalina papildomų tyrimų išlaidas.
Tačiau jei vykstantis antibakterinis gydymas neefektyvus, ligoninių infekcijų atveju, kai sunku atspėti sukėlėją ir jo jautrumą antibiotikams, jie linkę atlikti etiotropinį gydymą. Etiotropinis antibiotikų receptas apima ne tik infekcijos sukėlėjo išskyrimą iš klinikinės medžiagos, bet ir jo jautrumo antibiotikams nustatymą. Gauti teisingus duomenis galima tik kompetentingai įgyvendinus visus bakteriologinio tyrimo etapus: nuo klinikinės medžiagos paėmimo, transportavimo į bakteriologinę laboratoriją, patogeno nustatymo iki jo jautrumo antibiotikams nustatymo ir gautų rezultatų interpretavimo.
Antroji priežastis, dėl kurios reikia nustatyti mikroorganizmų jautrumą antibakteriniams vaistams, yra gauti epidemiologinius duomenis apie bendruomenėje įgytų ir hospitalinių infekcijų sukėlėjų atsparumo struktūrą. Praktiškai šie duomenys naudojami empiriškai skiriant antibiotikus, taip pat formuojant ligoninių receptus.
Jautrumo antibiotikams nustatymo metodai
Bakterijų jautrumo antibiotikams nustatymo metodai skirstomi į 2 grupes: difuzijos ir skiedimo metodai.
Nustatant jautrumą disko difuzijos metodu, ant agaro paviršiaus Petri lėkštelėje uždedama tam tikro tankio bakterijų suspensija (dažniausiai atitinkanti McFarland drumstumo standartą 0,5), o po to dedami diskeliai, kuriuose yra tam tikras antibiotiko kiekis. . Dėl antibiotikų difuzijos į agarą aplink diskus susidaro mikroorganizmų augimo slopinimo zona. Per naktį indus inkubavus termostate 35 o -37 o C temperatūroje, į rezultatą atsižvelgiama išmatuojant zonos aplink diską skersmenį milimetrais ().
1 paveikslas. Mikroorganizmų jautrumo nustatymas disko difuzijos metodu.
Mikroorganizmo jautrumo nustatymas E-testu atliekamas panašiai kaip ir disko difuzijos metodu. Skirtumas tas, kad vietoj disko su antibiotikais naudojama E-testo juostelė, kurioje yra antibiotikų koncentracijos gradientas nuo didžiausios iki minimalios (). Elipsoidinės augimo slopinimo zonos sankirtoje su E-testo juostele gaunama minimalios slopinančios koncentracijos (MIC) reikšmė.
2 pav. Mikroorganizmų jautrumo nustatymas naudojant E-testus.
Neabejotinas difuzijos metodų pranašumas yra bandymo paprastumas ir prieinamumas bet kurioje bakteriologinėje laboratorijoje. Tačiau, atsižvelgiant į didelę E-testų kainą, įprastam darbui dažniausiai naudojamas disko difuzijos metodas.
Veisimo būdai yra pagrįsti dvigubų serijinių antibiotikų koncentracijos skiedimų naudojimu nuo didžiausios iki mažiausios (pavyzdžiui, nuo 128 μg/ml, 64 μg/ml ir tt iki 0,5 μg/ml, 0,25 μg/ml ir 0,125 μg/ml). Šiuo atveju įvairios koncentracijos antibiotikas dedamas į skystą maistinę terpę (sultinį) arba agarą. Tada tam tikro tankio bakterijų suspensija, atitinkanti McFarland drumstumo standartą 0,5, dedama į antibiotikų sultinį arba ant agaro plokštelės paviršiaus. Po inkubacijos per naktį 35 o -37 o C temperatūroje gauti rezultatai užrašomi. Mikroorganizmų augimo buvimas sultinyje (sulinio drumstumas) arba agaro paviršiuje rodo, kad nurodytos antibiotiko koncentracijos nepakanka jo gyvybingumui slopinti. Didėjant antibiotikų koncentracijai, mikroorganizmo augimas blogėja. Pirmoji mažiausia antibiotikų koncentracija (iš serijinių skiedimų), kai bakterijų augimas nėra vizualiai nustatytas, laikoma minimali slopinanti koncentracija (MIC). MIC matuojamas mg/l arba μg/ml ().
3 pav. MIC reikšmės nustatymas skiedžiant skystoje maistinėje terpėje.
Jautrumo rezultatų interpretavimas
Remiantis gautais kiekybiniais duomenimis (antibiotiko augimo slopinimo zonos skersmuo arba MIC reikšmė), mikroorganizmai skirstomi į jautrius, vidutiniškai atsparius ir atsparius (). Norint atskirti šias tris jautrumo (arba pasipriešinimo) kategorijas, vadinamieji ribinės koncentracijos(lūžio taškas) antibiotikas (arba mikroorganizmų augimo slopinimo zonos skersmens ribinės vertės).
4 pav. Bakterijų jautrumo nustatymo pagal MIC reikšmes rezultatų interpretavimas.
Ribinės koncentracijos nėra nekintančios vertės. Jie gali būti peržiūrimi, atsižvelgiant į mikrobų populiacijos jautrumo pokyčius. Aiškinimo kriterijų kūrimą ir peržiūrą atlieka pirmaujantys specialistai (chemoterapeutai ir mikrobiologai), kurie yra specialių komitetų nariai. Vienas iš jų – JAV Nacionalinis klinikinių laboratorijų standartų komitetas (NCCLS). Šiuo metu NCCLS standartai yra pripažinti visame pasaulyje ir naudojami kaip tarptautiniai standartai vertinant bakterijų jautrumo nustatymo rezultatus daugiacentriuose mikrobiologiniuose ir klinikiniuose tyrimuose.
Yra du jautrumo rezultatų aiškinimo būdai: mikrobiologinis ir klinikinis. Mikrobiologinis aiškinimas pagrįstas antibiotikų koncentracijų, slopinančių bakterijų gyvybingumą, pasiskirstymo analize. Klinikinis aiškinimas pagrįstas antibiotikų terapijos veiksmingumo įvertinimu.
Jautrūs mikroorganizmai (jautrūs)
Kliniškai bakterijos klasifikuojamos kaip jautrios (atsižvelgiant į gautus parametrus in vitro), jei gydant šių mikroorganizmų sukeltas infekcijas standartinėmis antibiotikų dozėmis, pastebimas geras gydomasis poveikis.
Nesant patikimos klinikinės informacijos, skirstymas į jautrumo kategorijas grindžiamas bendra gautų duomenų ataskaita in vitro, o farmakokinetika, t.y. apie antibiotikų koncentraciją, pasiekiamą infekcijos vietoje (arba kraujo serume).
Atsparūs mikroorganizmai
Bakterijos priskiriamos atsparioms (atsparioms), kai, gydant šių mikroorganizmų sukeltą infekciją, gydymo efekto nėra net vartojant maksimalias antibiotikų dozes. Tokie mikroorganizmai turi atsparumo mechanizmus.
Mikroorganizmai, turintys vidutinį atsparumą (tarpinis)
Klinikiniu požiūriu vidutinis bakterijų atsparumas reiškia, kad tokių padermių sukeltos infekcijos gali turėti skirtingą terapinį poveikį. Tačiau gydymas gali būti sėkmingas, jei antibiotikas vartojamas didesnėmis nei standartinėmis dozėmis arba infekcija yra lokalizuota toje vietoje, kur antibakterinis vaistas kaupiasi didelėmis koncentracijomis.
Mikrobiologiniu požiūriu bakterijos, turinčios vidutinį atsparumą, apima subpopuliaciją, kuri pagal MIC vertes arba zonos skersmenis yra tarp jautrių ir atsparių mikroorganizmų. Kartais vidutiniškai atsparios padermės ir atsparios bakterijos sujungiamos į vieną atsparių mikroorganizmų kategoriją.
Pažymėtina, kad klinikinis bakterijų jautrumo antibiotikams aiškinimas yra sąlyginis, nes gydymo rezultatas ne visada priklauso tik nuo antibakterinio vaisto aktyvumo prieš patogeną. Remiantis tyrimais, gydytojai žino atvejų, kai mikroorganizmai yra atsparūs in vitro, gavo gerą klinikinį poveikį. Ir atvirkščiai, jei patogenas yra jautrus, gydymas gali būti neveiksmingas.
Tam tikrose klinikinėse situacijose, kai jautrumo tyrimo įprastiniais metodais rezultatų nepakanka, nustatoma minimali baktericidinė koncentracija.
Minimali baktericidinė koncentracija (MBC)– mažiausia antibiotiko koncentracija (mg/l arba μg/ml), kuri tyrimo metu in vitro sukelia 99,9% mikroorganizmų mirtį nuo pradinio lygio per tam tikrą laikotarpį.
MBC reikšmė naudojama gydant antibiotikais, turinčiais bakteriostatinį poveikį, arba kai nėra antibakterinio gydymo poveikio specialioje pacientų kategorijoje. Ypatingi MBC nustatymo atvejai gali būti, pavyzdžiui, bakterinis endokarditas, osteomielitas arba generalizuotos infekcijos pacientams, kuriems yra imunodeficito būklė.
Baigdamas norėčiau pastebėti, kad šiandien nėra metodų, kurie leistų visiškai užtikrintai prognozuoti antibiotikų klinikinį poveikį gydant infekcines ligas. Tačiau šie jautrumo rezultatai gali būti geras vadovas, padedantis gydytojams pasirinkti ir koreguoti antibakterinį gydymą.
1 lentelė. Bakterijų jautrumo aiškinimo kriterijai
Etest® yra inertinė plastikinė juostelė, kurioje yra antimikrobinės medžiagos koncentracijos gradientu nuo minimalios iki didžiausios, diapazone, atitinkančiame 15 2 kartų praskiedimus. Kitoje juostelės pusėje yra atitinkamos minimalios slopinančios koncentracijos (MIC) skalė. E-testai leidžia nustatyti minimalią antimikrobinio vaisto slopinančią koncentraciją (kiekybinės difuzijos metodas).
. Lėkštelę pasėkite mikroorganizmo kultūra.
. Uždėkite Etest® juosteles (iki 2 į standartinį 90 mm skersmens puodelį arba iki 6 į 180 mm skersmens puodelį).
. Auginimo proceso metu aplink juostelę susiformuos elipsoidinė augimo slopinimo zona, kuri kerta juostą taške, atitinkančiame MIC.
. E-testai naudojami daugiau nei 20 metų.
. Daugiau nei 100 antimikrobinių vaistų.
. Juostelės, skirtos nustatyti atsparumą daugeliui vaistų.
. Išrankių mikroorganizmų, streptokokų, anaerobinių mikroorganizmų, grybelių (taip pat ir pelėsių), mikobakterijų tuberkuliozės ir kt. jautrumo nustatymas.
. Patogi išleidimo forma: 30 arba 100 vienetų, lizdinėje plokštelėje arba putplasčio kasetėje.
| Katalogo numeris | |||||
| Individualus paketą |
Putplasčio kasetė (laikymo temperatūra +20°С / +4°С) |
(laikymo temperatūra -20°С) |
|||
| vardas | 30 juostelių | 100 juostelių | 30 juostelių | 100 juostelių | 30 juostelių |
| Priešgrybelinis | |||||
| E-testas Amfotericinas | 526318 | 526310 | |||
| E-testas Anidulafunginas | 532008 | 532000 | |||
| E-testas Vorikonazolas | 532818 | 532810 | |||
| E-testas Itrakonazolas | 412380 | 525818 | 525810 | ||
| E-testas kaspofunginas | 412269 | 532418 | 532410 | ||
| E-testas Ketokonazolas | 525918 | 525910 | |||
| E-testas Micafungin | 535708 | 535700 | |||
| E-testas Posakonazolas | 532118 | 532110 | |||
| E-testas Flukonazolas | 412350 | 510818 | 510810 | ||
| E-testas Flucitozinas | 510918 | 510910 | |||
| Antituberkuliozė | |||||
| E-testas Izoniazidas | 527900 | ||||
| E-testas Etambutolis | 527700 | ||||
| E-testas Etionamidas | 527500 | ||||
| Antibakterinis | |||||
| E-testas azitromicinas | 412251 | 501618 | |||
| E-testas Aztreonamas | 412259 | 501718 | 501710 | ||
| E-testas Amikacinas | 412219 | 501318 | |||
| E-testas Amoksicilinas | 412243 | 500918 | |||
| E-testas Amoksicilinas/klavulano rūgštis (2/1) | 412241 | 501018 | 501010 | ||
| E-testas Ampicilinas | 412253 | 501518 | |||
| E-testas Ampicilinas/sulbaktamas (2/1) | 412251* | 501818 | 501810 | ||
| E-testas Bacitracinas | 528608 | 528600 | |||
| E-testas benzilpenicilinas (didelė koncentracija) | 412263 | 502518 | |||
| E-testas Benzilpenicilinas (maža koncentracija) | 412265 | 502618 | |||
| E-testas vankomicinas | 412488 | 525518 | |||
| E-testas Gatifloksacinas | 530218 | 530210 | |||
| E-testas Gentamicinas (didelė koncentracija) | 512708 | 512700 | |||
| E-testas Gentamicinas (maža koncentracija) | 412368 | 512518 | |||
| E-testas Daptomicinas | 412324 | 535018 | 535010 | ||
| E-testas Doksiciklinas | 412328*** | 509718 | 509710 | ||
| E-testas Doripenemas | 412326*** | 535918 | 535910 | ||
| E-testas Imipenemas | 412374 | 513618 | |||
| E-testas Kanamicinas | 527818 | 527810 | |||
| E-testas klaritromicinas | 508718 | 508710 | |||
| E-testas klindamicinas | 412315 | 509518 | |||
| E-testas Colistin | 412317** | 537308 | 537300 | ||
| E-testas Levofloksacinas | 412393 | 527418 | |||
| E-testas Linezolidas | 412396 | 531318 | |||
| E-testas Meropenemas | 412402 | 513818 | |||
| E-testas Metronidazolas | 412404 | 530018 | |||
| E-testas Mecillinam | 513708 | 513700 | |||
| E-testas Minociklinas | 412409*** | 516018 | 516010 | ||
| E-testas moksifloksacinas | 412411** | 529018 | 529010 | ||
| E-testas Mupirocinas | 412417*** | 413496 | 516300 | ||
| E-testas Nalidikso rūgštis | 516508 | 516500 | |||
| E-testas Netilmicinas | 517518 | 517510 | |||
| E-testas Nitrofurantoinas | 412426*** | 530408 | 530400 | ||
| E-testas Norfloklacinas | 412428** | 519508 | 519500 | ||
| E-testas Oksacilinas | 412432 | 520518 | |||
| E-testas Ofloksacinas | 519618 | 519610 | |||
| E-testas piperacilinas | 521518 | 521510 | |||
| E-testas Piperacilinas/tazobaktamas (4 µg/ml) | 412434 | 521418 | |||
| E-testas Polimiksinas | 533408 | 533400 | |||
| E-testas Rifampicinas | 412450 | 526018 | 526010 | ||
| E-testas Spectinomicinas | 529218 | 529210 | |||
| E-testas Streptomicinas | 412454 | 526808 | 526800 | ||
| E-testas Sulfametoksazolas | 534118 | 534110 | |||
| E-testas Teicoplanin | 412461 | 522018 | |||
| E-testas Tetraciklinas | 412471 | 522518 | |||
| E-testas Tigeciklinas | 412475 | 533518 | |||
| E-testas Tikarcilinas/klavulano rūgštis | 522618 | 522610 | |||
| E-testas Tobramicinas (didelė koncentracija) | 533108 | 533100 | |||
| E-testas Tobramicinas (maža koncentracija) | 522718 | 522710 | |||
| Trimetoprimo E testas | 523618 | 523610 | |||
| E-testas Trimetoprimas/sulfametoksazolas (1/16) | 412481 | 524418 | |||
| E-testas Fosfomicinas | 529108 | 529100 | |||
| E-testas Fusidino rūgštis | 511518 | 511510 | |||
| E-testas Kvinupristinas/dalfopristinas | 528718 | 528710 | |||
| E-testas Chloramfenikolis | 412309 | 507518 | 507510 | ||
| E-testas Cefaclor | 504518 | 504510 | |||
| E-testas Cefalotinas | 412307 | 503518 | 503510 | ||
| E-testas Cefepimas | 412273 | 505018 | 505010 | ||
| E-testas Cefixime | 412275 | 529918 | 529910 | ||
| E-testas Cefoksitinas | 412285 | 506518 | 506510 | ||
| E-testas Cefoperazonas/sulbaktamas (2/1) | 529318 | 529310 | |||
| E-testas Cefotaksimas (didelė koncentracija) | 412279 | 505518 | |||
| E-testas Cefotaksimas (maža koncentracija) | 412281 | 505618 | |||
| E-testas Cefotetan | 506308 | 506300 | |||
| E-testas su Cefpir | 506408 | 506400 | |||
| E-testas Cefpodoksimas | 505818 | 505810 | |||
| E-testas Ceftazidimas | 412293 | 506718 | |||
| E-testas Ceftarolinas | 412291 | ||||
| E-testas Ceftizoksimas | 527308 | 527300 | |||
| E-testas Ceftobiprolis | 412297 | ||||
| E-testas Ceftriaksonas (didelė koncentracija) | 412301 | 506618 | 506700 | ||
| E-testas Ceftriaksonas (maža koncentracija) | 412303 | 507018 | 507000 | ||
| E-testas Cefuroksimas | 506918 | 506910 | |||
| E-testas Ciprofloksacinas | 412311 | 508618 | |||
| E-testas Enrofloksacinas | 528908 | 528900 | |||
| E-testas Eritromicinas | 412334 | 510518 | |||
| E-testas Ertapenem | 412332 | 531618 | 531610 | ||
| Skaičius pagal katalogą |
|||
| Individualus paketą |
Plastikinė sekcinė pakuotė (laikymo temperatūra -20°С) |
||
| vardas | 30 juostelių | 100 juostelių | 30 juostelių |
| Daugelio vaistų atsparumo nustatymas | |||
| E-testas cefotaksimas / cefotaksimas + klavulano rūgštis (4 μg/ml) |
412336** | 532208 | 532200 |
| E-testas Ceftazidimas / Ceftazidimas + klavulano rūgštis (4 μg/ml) Sukurta nustatyti išplėstinio spektro beta laktamazės fermentų (ESBL), slopintų klavulano rūgšties, buvimą gramneigiamose bakterijose, įskaitant Klebsiella spp., Escherichia coli, Proteus mirabilis, kitus Enterobacteriaceae šeimos narius, Pseudomonas aeruginosa |
412340** | 532508 | 532500 |
| E-testas Cefepimas / Cefepimas + klavulano rūgštis (4 μg/ml) Sukurta nustatyti išplėstinio spektro beta laktamazės fermentų (ESBL), slopintų klavulano rūgšties, buvimą gramneigiamose bakterijose, įskaitant Klebsiella spp., Escherichia coli, Proteus mirabilis, kitus Enterobacteriaceae šeimos narius, Pseudomonas aeruginosa |
412338** | 534708 | 534700 |
| E-testas Imipenemas / Imipenemas + EDTA Skirtas metalo-beta-laktamazės fermentų buvimui gramneigiamose bakterijose, įskaitant Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., nustatyti. | 534208 | 534200 | |
| E-testas Vankomicinas / Teikoplaninas Sukurtas nustatyti atsparumą (arba vidutinį atsparumą) gramteigiamų bakterijų, įskaitant Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., glikopeptidams. |
537208 | 537200 | |
| E-testas Cefotetan / Cefotetan + Klaksacilinas Sukurta nustatyti AmpC-beta-laktamazės fermentų buvimą gramneigiamose bakterijose |
537108 | 537100 | |
Šioje dalyje apžvelgsime end-to-end (E2E) testavimą: išbandysime visą aplikaciją ir tai darysime iš vartotojo pusės, iš esmės automatizuodami visus jo veiksmus.
Mūsų atveju programa susideda tik iš frontend - tiesiog nėra backend, todėl E2E testavimas susideda iš programos atidarymo tikroje naršyklėje, skaičiavimų rinkinio atlikimo ir reikšmės ekrane patikrinimo.
Ar turime patikrinti visas permutacijas, kaip tai darėme vienetų testuose? Ne, nes tai jau patikrinta! E2E testuose tikriname ne atskirų mazgų, o visos sistemos veikimą iš karto.
Kiek E2E testų reikia?
Pirmoji priežastis, kodėl tokių testų neturėtų būti daug, yra ta, kad turėtų pakakti gerai parašytų integravimo ir vienetinių testų. E2E bandymai turi patikrinti, ar visi elementai yra tinkamai sujungti vienas su kitu.
Antra priežastis – jie lėti. Jei jų yra šimtas, pavyzdžiui, vienetų ir integravimo testai, tada bus atliekami bandymai Labai ilgam laikui.
Trečioji priežastis – nenuspėjamas E2E testų elgesys. „Google“ testavimo tinklaraštyje yra įrašas apie šį reiškinį. Vienetų testai nerodo tokio nestabilaus elgesio. Jie gali praeiti arba kristi – ir be matomų pakitimų, tik dėl įvesties / išvesties. Ar įmanoma pašalinti nenuspėjamumą? Ne, bet jūs galite tai sumažinti.
Kad išvengtumėte nenuspėjamumo, atlikite kuo mažiau E2E testų. Parašykite vieną E2E testą dešimčiai kitų ir tik tada, kai jie tikrai reikalingi.
E2E testų rašymas
Pereikime prie E2E testų rašymo. Mums reikia dviejų dalykų: naršyklės ir serverio priekiniam kodui.
Pirmiausia pažvelkime į žiniatinklio serverio nustatymą.
„Mocha“ žiniatinklio serverio nustatymas
Žiniatinklio serveris mazge? Iš karto ateina į galvą Express, pažiūrėkime į kodą:
Leisti serveriui prieš((atlikta) => ( const app = express() app.use("/", express.static(path.resolve(__dirname, "../../dist"))) serveris = programa. klausytis(8080, padaryta) )) po(() => ( server.close() ))
Funkcijoje „prieš“ sukuriame greitąją programą, nukreipiame ją į dist aplanką ir nustatome klausytis prie 8080 prievado. „After“ funkcijoje „nužudome“ serverį.
Dist aplankas yra vieta, kurioje saugome savo JS scenarijus ir kur kopijuojame HTML ir CSS failus. Matote, kad tai darome npm kūrimo scenarijuje pakete.json:
( "name": "frontend-testing", "scripts": ( "build": "webpack && cp public/* dist", "test": "mocha "test/**/test-*.js" && eslint test lib", ... ),
Tai reiškia, kad atliekant E2E testus pirmiausia reikia paleisti npm run build ir tada npm testą. Taip, tai nepatogu. Atliekant vienetų testus, tai nėra būtina, nes jie veikia pagal mazgą ir nereikalauja vertimo bei surinkimo.
Norėdami išsamumo, pažvelkime į webpack.config.js, kuriame aprašoma, kaip Webpack turėtų kurti failus:
Module.exports = ( įrašas: "./lib/app.js", išvestis: ( failo pavadinimas: "bundle.js", kelias: path.resolve(__adresas, "dist") ), ... )
Aplankas dist naudojamas tiek vartotojo aplinkoje, tiek E2E testuose. Tai svarbu – turite atlikti E2E testus aplinkoje, kuri yra kuo panašesnė į „kovinę“ aplinką.
Naršyklės nustatymai Mocha
Mūsų programa įdiegta serveryje – belieka paleisti jai skirtą naršyklę. Kurią biblioteką naudosime automatizavimui? Dažniausiai naudoju populiarią seleno žiniatinklio tvarkyklę.
Pirmiausia pažiūrėkime, kaip jį naudojame, prieš pereidami prie nustatymų:
Const (prepareDriver, cleanupDriver) = reikalauti(../utils/browser-automation") //... description("skaičiuotuvo programa", funkcija () ( leiskite tvarkyklei ... before(async () => ( vairuotojas) = laukti paruoštiVairuotojo() )) po(() => valymoVairuotojas(tvarkyklės)) it("turėtų veikti", asinchronizavimo funkcija () ( laukti driver.get("http://localhost:8080") //... )))
Funkcijoje „prieš“ paruošiame vairuotoją, o „after“ – išvalome. Paruošus tvarkyklę, naršyklė bus paleista, o išvalius ji bus uždaryta. Atminkite, kad tvarkyklės nustatymas vyksta asinchroniškai ir galime naudoti async/wait, kad kodas būtų gražesnis.
Bandymo funkcijoje atidarome adresą http://localhost:8080, vėl naudodami await, nes driver.get yra asinchroninė funkcija.
Taigi, kaip atrodo readyDriver ir cleanupDriver?
Const žiniatinklio tvarkyklė = reikalauti("seleno žiniatinklio tvarkyklė") const chromeDriver = reikalauti("chromedriver") const kelias = reikalauti("kelias") const chromeDriverPathAddition = `:$(path.dirname(chromeDriver.path))` exports.prepareDriver = async () => ( process.on("beforeExit", () => this.browser && this.browser.quit()) process.env.PATH += chromeDriverPathAddition grįžimas laukia naujos žiniatinklio tvarkyklės.Builder() .disableEnvironmentOverrides() .forBrowser("chrome") .setLoggingPrefs((naršyklė: "VISI", tvarkyklė: "VISI")) .build() ) exports.cleanupDriver = async (tvarkyklė) => ( if (tvarkyklė) ( driver.quit() ) process.env.PATH = process.env.PATH.replace(chromeDriverPathAddition, "") )
Tai sudėtingas dalykas. Ir turiu kai ką pripažinti: šis kodas buvo parašytas krauju (o, ir jis veikia tik Unix sistemose). Jis buvo parašytas naudojant „Google“, „Stack Overflow“ ir žiniatinklio tvarkyklės dokumentaciją ir smarkiai pakeistas moksliniu būdu. Bet tai veikia!
Teoriškai galite tiesiog nukopijuoti ir įklijuoti kodą į savo testus jo nesuprasdami, bet pažiūrėkime trumpam.
Pirmosios dvi eilutės jungia žiniatinklio tvarkyklę - naršyklės tvarkyklę. Selenium Webdriver veikia taip, kad ji turi API (seleno žiniatinklio tvarkyklės modulyje, kurį importuojame 1 eilutėje), kuri veikia su bet kuria naršykle ir priklauso nuo naršyklės tvarkyklių... skirtingos naršyklės. Mano naudojama tvarkyklė yra chromedriver, importuota iš 2 eilutės.
„Chrome“ tvarkyklei įrenginyje nereikia naršyklės: ji iš tikrųjų įdiegia savo vykdomąjį failą „Chrome“ failas kai įdiegiate npm . Deja, kažkodėl negaliu suprasti, neranda ir chromedriver katalogą reikia įtraukti į PATH (būtent tai neveikia Windows). Tai darome 9 eilutėje. Taip pat pašaliname jį iš PATH, kai atliekame valymo veiksmą, 22 eilutėje.
Taigi, mes sukonfigūravome naršyklės tvarkyklę. Dabar atėjo laikas sukonfigūruoti (ir grąžinti) žiniatinklio tvarkyklę, ką mes darome 11–15 eilutėse. Ir kadangi kūrimo funkcija yra asinchroninė ir grįžta, laukiame jos naudodami await.
Kodėl tai darome 11–15 eilutėse? Priežastys slypi patirties migloje. Nedvejodami nukopijuokite ir įklijuokite – jokių garantijų nėra, bet kurį laiką naudoju šį kodą be problemų.
Pradėkime bandymus
Baigėme sąranką – laikas pažvelgti į kodą, kurį žiniatinklio tvarkyklė naudoja naršyklei valdyti ir mūsų kodui išbandyti.
Klasifikacija, bendrieji įgyvendinimo būdai. Difuzijos metodai: popierinio disko metodas, E-testas.Bakterijų jautrumo antibiotikams nustatymo metodai skirstomi į 2 grupes:
1. Difuzijos metodai:
. naudojant antibiotikų diskus
. naudojant E-testus
2. Serijinio skiedimo metodai:
. praskiedimas skystoje maistinėje terpėje (sultinyje)
. praskiedimas agaro terpėje
Jautrumo nustatymo metodai buvo sukurti septintojo dešimtmečio antroje pusėje – XX amžiaus 70-ųjų pradžioje ir nuo to laiko metodologiniu požiūriu esminių pokyčių nebuvo.
Šie veiksmai yra bendri visiems metodams:
- maistinių terpių paruošimas ir kokybės kontrolė
- tiriamųjų mikroorganizmų suspensijos (inokuliato) paruošimas
- skiepijimas
- difuzijos metodams - E-testo diskų ar juostelių uždėjimo ant kietos maistinės terpės etapas.
- inkubacija
- rezultatų registravimas ir interpretavimas
- gydymo rekomendacijų formulavimas
Difuzijos metodai yra pagrįsti antibakterinio vaisto (AKŠ) difuzija iš nešiklio į kietą maistinę terpę, užkrėstą mikroorganizmu, ir tiriamo mikroorganizmo augimo slopinimo (uždelsimo) zonos skersmens registravimu.
. Šis metodas yra mažiau jautrus ir ne toks tikslus, kaip serijinio skiedimo metodas, tačiau dėl savo paprastumo praktikoje naudojamas dažniau. Paskelbta ref.rf.
. Bet kurio vaisto difuzijos į agarą greitis priklauso nuo jo struktūros, molekulinės masės, priemaišų buvimo, terpės sudėties ir pH.
Popierinių diskų su antibiotikais metodas (disko difuzijos metodas).
. Norėdami atlikti šį metodą, naudokite standartiniai ratai, kuriame yra tam tikras antibiotikų kiekis ir standartinė maistinė terpė, reikalinga šio tipo mikroorganizmams augti. Tam tikrose ribose augimo slopinimo zonos skersmuo yra atvirkščiai proporcingas MIC. . Petri lėkštelėje ant agaro paviršiaus užtepama tam tikro tankio bakterijų suspensija. . Dedami diskai, kuriuose yra tam tikras antibiotikų kiekis. . Inkubuokite kiekvienam konkrečiam mikroorganizmui palankiomis sąlygomis. . Augimo slopinimo zonų aplink diską skersmenys matuojami milimetrais (atsižvelgiant į disko skersmenį). . Rezultatas vertinamas naudojant specialią lentelę, lyginant tiriamo pasėlio augimo slopinimo zonų skersmenį su zonos skersmens ribinėmis vertėmis lentelėje. . Tiriama kultūra skirstoma į vieną iš trijų kategorijų: jautri, vidutiniškai jautri ir atspari. 
E-testas (E-testas arba epsiometrinis metodas)
Metodas savo technologijomis artimas popierinio disko metodui.
. Kaip nešiklis naudojama siaura polimero juostelė (0,5x6,0 cm), ant kurios uždedamas GKŠP koncentracijų gradientas (nuo minimalios iki didžiausios). GKŠP koncentracijos vertės kiekvienoje juostelės dalyje yra pažymėtos išoriniame (atsuktame į tyrėją) paviršiuje.
. Mikroorganizmų augimas aplink nešiklio juostelę slopinamas toje zonoje, kurioje iš nešiklio difunduojančių antibiotikų koncentracija yra didesnė už MIC.
. Elipsoidinės augimo slopinimo zonos sankirtoje su E-testo juostele gaunama MIC reikšmė.
E-testas sujungia popieriaus disko metodo paprastumą ir serijinio skiedimo metodo tikslumą. 
Antimikrobinės terapijos vaistų lyginamajam in vitro įvertinimui taikomi metodai: serijinio skiedimo skystose ir kietose maistinėse terpėse metodas.
Serijinio skiedimo metodai:
. Jie leidžia kiekybiškai įvertinti izoliuoto mikroorganizmo jautrumą antibakterinėms medžiagoms ir nustatyti vaisto MIC.
. Naudojamas kuriamo generinio vaisto ir originalaus vaisto antimikrobinio aktyvumo in vitro palyginimui.
. Norint nustatyti MIC reikšmę, į maistinę terpę įpilama nurodytos koncentracijos antibiotikų, kuri vėliau pasėjama tiriamo mikroorganizmo kultūra. Po inkubacijos įvertinamas matomo augimo buvimas ar nebuvimas.
. Remiantis dvigubais serijiniais GKŠP koncentracijų skiedimais nuo didžiausios iki mažiausios (pvz., nuo 128 μg/ml, 64 μg/ml ir tt iki 0,5 μg/ml, 0,25 μg/ml ir 0,125 μg/ml ) .
. Jie atliekami skystoje ir agaro maistinėje terpėje. Serijinio skiedimo skystoje maistinėje terpėje (sultinyje) metodas
Yra 2 šio metodo parinktys:
makrometodas (mėgintuvėlis) ir mikrometodas (lėkštelė).
Makro metodas.
. Bandymas atliekamas mėgintuvėliuose, kurių kiekvieno skiedimo galutinis tūris yra 1 ml.
. Maistinės medžiagos sultinys įpilamas į kiekvieną mėgintuvėlį po 0,5 ml. Mėgintuvėlių skaičius nustatomas pagal reikiamą GKŠP skiedimo diapazoną.
. Tirtų mikroorganizmų suspensijos paruošimas:
- Iš kiekvieno tiriamo mikroorganizmo standartinės suspensijos (~ 10 8 KSV/ml) paruošiama darbinė suspensija (~ 10 6 KSV/ml). Dvigubų serijinių GKŠP skiedimų paruošimas: - paruoškite bandomojo generinio vaisto ir etaloninio vaisto (originalaus) pradinį GKŠP tirpalą, kurio koncentracija yra 1000 μg/ml ir didesnė (atsižvelgiant į veikliosios medžiagos kiekį). . - iš tiriamo generinio vaisto ir etaloninio vaisto (originalaus) pagrindinių GKŠP tirpalų ruošiami GKŠP darbiniai tirpalai, naudojant skystą maistinę terpę. (Darbinių tirpalų koncentracija apskaičiuojama pagal reikiamą didžiausią koncentraciją serijinių skiedimų serijoje, atsižvelgiant į praskiedimo koeficientą vėlesnio sėjimo su mikroorganizmo suspensija metu) - paruošiami serijiniai skiedimai: 0,5 ml darbinio tirpalo GKŠP įdedama į pirmąjį mėgintuvėlį, kuriame yra 0,5 ml sultinio. Išmaišykite. Naudodami naują pipetę (galiuką), perpilkite 0,5 ml GKŠP tirpalo sultinyje į antrą mėgintuvėlį, kuriame yra 0,5 ml sultinio ir pan., kol reikalinga eilutė skiedimai. Iš paskutinio mėgintuvėlio išimama 0,5 ml. Taip gaunama serija mėgintuvėlių su GKŠP tirpalais, kurių koncentracijos gretimuose mėgintuvėliuose skiriasi 2 kartus. Inokuliacija: į kiekvieną mėgintuvėlį įpilama 0,5 ml mikrobų suspensijos, kurios mikroorganizmų koncentracija yra ~ 10 6, su 0,5 ml atitinkamo GKŠP skiedimo. Galutinė mikroorganizmo koncentracija kiekviename mėgintuvėlyje yra ~ 5x10 5 KSV/ml. . Kontrolė – mėgintuvėlis su sultiniu ir mikroorganizmų kultūra (augimo kontrolė). Neigiama kontrolė – mėgintuvėlis su sultiniu (sterilumo kontrolė). . Inkubavimas: visi mėgintuvėliai, užkimšti kamščiais arba dangteliais, inkubuojami tokiomis sąlygomis, kurios užtikrina tiriamųjų mikroorganizmų augimą. . Rezultatų registravimas ir interpretavimas: mėgintuvėliai su kultūromis apžiūrimi praleidžiamoje šviesoje. Kultūros augimas mėgintuvėlyje su ABP lyginamas su kontroliniu mėgintuvėliu. - mikroorganizmų augimo buvimas sultinyje (sultinio drumstumas) rodo, kad šios antibiotiko koncentracijos nepakanka jo gyvybingumui slopinti. - didėjant antibiotikų koncentracijai, pablogėja mikroorganizmo augimas. Pirmoji mažiausia antibiotiko koncentracija (iš serijinių skiedimų serijos), kai bakterijų augimas vizualiai nenustatomas, laikoma mažiausia slopinančia koncentracija (MIK). vaistai antibakterinei terapijai – palyginkite rezultatus, gautus naudojant pradinį vaistą ir tiriamą generinį vaistą. Daroma išvada apie jų lygiavertiškumą pagal spektrą (naudotų mikroorganizmų sąrašą) ir antimikrobinio aktyvumo laipsnį (MIC reikšmės). 
. MBC nustatymas: iš paskutinių kelių mėgintuvėlių su augimo sulėtėjimu pasėkite kilpą ant Petri lėkštelės sektorių. MBC, kuris, kaip taisyklė, yra keliais praskiedimais mažesnis už MIC, laikoma vaisto koncentracija paskutiniame mėgintuvėlyje, iš kurio kultūra neaugo. . Metodo trūkumas: mažas produktyvumas – taikymas apsiriboja nedidelio mikroorganizmų skaičiaus tyrimais.
Mikrometodas
.Tikrinimo procedūra panaši į makrometodą
.Galutinis tūris iki 0,2 ml.Atitinkamos laboratorinės įrangos prieinamumas: 96 šulinėlių plokštelė su steriliais dangteliais, kelių kanalų pipetės.Į plokštelės šulinėlius galima iš anksto įpilti GKŠP darbinius tirpalus, o po to laikyti sandariai uždarytus polietilene žemesnėje nei 60°C temperatūroje iki naudojimo momento. . Metodo pranašumai: - didelio našumo- galimybė ilgai laikyti iš anksto paruoštas tabletes - sutaupyti Prekės. Paskelbta ref.rf
Serijinio skiedimo agaro terpėje metodas. Bandymo principas panašus į sultinio skiedimo metodą. Bandomųjų mikroorganizmų suspensijos ruošimas: - kiekvieno tiriamo mikroorganizmo standartinėje suspensijoje turi būti ~ 10 8 KSV/ml. - standartinė eksperimento mikrobų suspensija skiedžiama ~ 10 kartų, kad būtų gauta ~ 10 7 CFU/ml mikroorganizmo koncentracija. Du kartus serijiniai GKŠP skiedimai pradiniam vaistui ir tiriamam generiniam vaistui ruošiami panašiai kaip skiedimo sultinyje metodas. Agaro terpė išlydoma ir atšaldoma iki 45-50°C temperatūros. . Lėkštelių su agaro terpe ir GKŠP skiedimais ruošimas: agaro terpę ir GKŠP tirpalus sumaišykite tiesiai Petri lėkštelėje (90 mm skersmens plastikinėms lėkštelėms į 2 ml GKŠP tirpalo įpilkite 18 ml ištirpinto ir atvėsinto agaro). . Inokuliacija ir inkubavimas: naudojant bakteriologinę kilpą į agaro terpės paviršių perkeliama 1-2 μl tiriamų mikroorganizmų suspensijos. Taigi galutinė inokuliato dozė yra ~10 4 CFU (standartinė 3 mm skersmens bakteriologinė kilpa perneša 1-2 µl skysčio). . Agaro paviršiuje susidaro 5-8 mm skersmens dėmė. Po džiovinimo indai apverčiami ir inkubuojami tiriamiems mikroorganizmams augti palankiomis sąlygomis. . Rezultatų registravimas ir interpretavimas: panašus į sultinio skiedimo metodą. Petri lėkštelės dedamos ant tamsaus, neatspindinčio paviršiaus. GKŠP koncentracija, sukėlusi visišką matomo augimo slopinimą, laikoma MIC. . Kontrolė: agaro plokštelės, pasėtos mikroorganizmų kultūrų suspensija be GKŠP (augimo kontrolė). Neigiama kontrolė: agaro plokštelės (sterilumo kontrolė). Metodo privalumai: vienoje plokštelėje galima nustatyti kelių mikroorganizmų jautrumą.
Generinių ir originalių antimikrobinių medžiagų antimikrobinio aktyvumo in vitro lyginamojo vertinimo tyrimų apimtis.
Generinių antimikrobinių vaistų antimikrobinio aktyvumo in vitro lyginamojo vertinimo tyrimų apimtis:
.Tyrimo tikslas: patvirtinti generinio vaisto atitiktį etaloniniam (originaliui) pagal antimikrobinio aktyvumo spektrą (mikroorganizmai) ir laipsnį (MIC, MBC reikšmė).
.Tirtų mikroorganizmų rinkinys: 1-2 kiekvieno mikroorganizmo padermės, įtrauktos į veikimo spektrą
- etaloninės kolekcijos padermės
- ligoninėse išskirtos klinikinės padermės
.Nustatomos MIC ir MBC reikšmės
.Kontrolė: etaloninis vaistas – originalus vaistas
.Tikėtinas rezultatas: sukurtų generinių antimikrobinių vaistų MIC ir MBC yra priimtinose verčių ribose ir visiškai sutampa su etaloninių vaistų (originalių vaistų) MIC ir MBC kolekcijų ir klinikinių padermių atžvilgiu.
Naujų antimikrobinių junginių antimikrobinio aktyvumo in vitro nustatymo tyrimų procedūra:
.Įvairių tipų gramneigiamų ir gramteigiamų mikroorganizmų etaloninių padermių pirminis jautrumo naujiems junginiams įvertinimas (kiekvienai rūšiai po 4-5 padermes);
.Išsamus junginių antibakterinio aktyvumo prieš gramneigiamų ir gramteigiamų mikroorganizmų padermes iš tarptautinių kolekcijų, turinčių žinomus atsparumo mechanizmus, laipsnio tyrimas (serijinio skiedimo metodas);
.Aktyvumo prieš klinikines oportunistinių ir patogeninių mikroorganizmų padermes tyrimas, lyginant su žinomais panašios cheminės grupės ar panašaus antimikrobinio poveikio vaistais:
- esant vyraujančiam aktyvumui prieš gramteigiamus mikroorganizmus, kontrolė - natūralūs penicilinai, pirmosios ir antrosios kartos cefalosporinai, makrolidai, linkozamidai; - aktyvumui prieš gramneigiamus mikroorganizmus, kontrolei - polimiksinas B, aztreonamas; - plataus veikimo spektro vaistams, kontroliniai - pusiau sintetiniai penicilinai, aminoglikozidai, tetraciklinai, III - IV kartos cefalosporinai
. Antimikrobinio aktyvumo prieš probleminius sukėlėjus: meticilinui atsparius stafilokokus, benzilpenicilinui atsparias Streptococcus pneumonijas, daugeliui vaistų atsparias enterobakterijas, aminoglikozidams atsparias Pseudomonas genties bakterijas ir kt.
.Naujų vaistų pradinės terapinės koncentracijos nustatomos atsižvelgiant į toksiškumą, nustatytą ūmaus toksiškumo eksperimentuose;
. Lyginamasis vaistų antibakterinio aktyvumo laipsnis vertinamas pagal MIC arba MBC vertę, nustačius ne mažiau kaip 2 sėklos dozės reikšmes: minimali - 10 4 - 10 5 KSV/ml ir didžiausia - 10 6 - 10 9 KSV. /ml, priklausomai nuo patogeno tipo ; Iki šiol nėra metodų, kurie leistų visiškai tiksliai prognozuoti klinikinį antibiotikų poveikį gydant infekcines ligas. Tačiau šie jautrumo rezultatai gali būti geras vadovas, padedantis gydytojams pasirinkti ir koreguoti antibakterinį gydymą.
Knygos turinys atidaromas uždaryti
1. Farmacinė mikrobiologija. Farmacinės mikrobiologijos dalykas ir uždaviniai.
2. Farmacija ir farmacija: atsiradimo ir raidos istorija.
3. Medicina: apibrėžimas, klasifikacija.
4. Vaistų sudėtis | farmacinė medžiaga, pagalbinė medžiaga.
5. Originalūs ir generiniai vaistai. Vaistų pavadinimas.
10. Žalingų veiksnių poveikis mikroorganizmams. Temperatūros faktoriaus įtaka ir jo naudojimas farmacijoje.
11. Radiacijos poveikis mikroorganizmams, spinduliuotės rūšys.
12. Cheminių žalingų veiksnių įtaka mikroorganizmams
13. Sterilizacija. Sterilumo užtikrinimo lygis (SAL). Sterilizacijos metodo pasirinkimo kriterijai.
14. Terminis ir cheminis sterilizavimas
15. Sterilizavimo prietaisų efektyvumo stebėjimas.
16. Pramoninė dezinfekcija
17. Dezinfekavimo priemonės ir antiseptikai. Reikalavimai cheminėms dezinfekavimo priemonėms ir antiseptikams.
18. Konservantai ir jų naudojimas farmacijos gamyboje
